采用定量蛋白质组学技术筛选与鼻咽癌发生和转移相关的甲基化失活基因

为揭示DNA异常甲基化在鼻咽癌发生与转移中的作用，项目首先以模拟鼻咽癌发生与发展过程的细胞系（永生化的正常鼻咽上皮细胞系NP69，遗传背景相同但转移能力不同的2株鼻咽癌细胞系6-10B和5-8F）为样本，采用定量蛋白质组学技术（2D-DIGE结合质谱）与DNA甲基化检测技术相结合的手段，寻找三株细胞系经甲基转移酶抑制剂处理前后的差异，从全基因组范围筛选与鼻咽癌发生和转移相关的甲基化失活基因；再以正常鼻咽粘膜组织、鼻咽癌组织和颈淋巴结转移癌组织为样本，对从细胞系中筛选到的甲基化失活基因进行验证，筛选出与临床鼻咽癌发生和转移相关的甲基化失活基因。最后以初诊鼻咽癌患者血液为样本，分析血液中鼻咽癌转移相关的甲基化基因用于鼻咽癌转移预警的价值。项目研究结果不仅有助于揭示DNA异常甲基化在鼻咽癌发生与转移中的作用，而且有望为鼻咽癌转移预警提供血清标志物。

本项目以模拟鼻咽癌发生与发展过程的细胞系5-8F、6-10B和NP69为样本，通过MTT及流式细胞术确定甲基化抑制剂5’-杂氮-2-脱氧胞苷（5-aza-2’-dC）作用于5-8F及6-10B的最佳作用时间和浓度，然后采用ITRAQ结合质谱与DNA甲基化检测技术相结合的手段辅以生物信息学分析，筛选与鼻咽癌发生和转移相关的甲基化失活基因及相关蛋白，通过细胞及临床样本验证，筛选有价值的甲基化失活基因或相关蛋白质。研究结果显示：5-aza-2’-dC对于5-8F和6-10B最佳作用时间为4天，最佳作用浓度分别为10μmol/L和5μmol/L。经iTRAQ结合质谱鉴定出非冗余蛋白876个，其中727个蛋白鉴定了两个或者两个以上肽段。通过生物信息学分析，从中筛选出转移和发生相关差异蛋白分别为190和208个。其中DIABLO/ SMAC、PDIA4/ ERP72、CALR、ANXA6在6-10B中表达显著高于5-8F细胞，而SQSTM1、TRIM29/ATDC、PPIA、RAN、S100A10在5-8F中表达上调。PDIA4/ERP72、ANXA6在鼻咽癌发展变化中逐渐下调，TRIM29则逐渐上调。通过转染证明了TRIM29高表达促进鼻咽癌的侵袭转移能力。免疫组化证实RAN、SQSTM1和TRIM29这三种蛋白在转移鼻咽癌中表达高于未转移组织，单独鉴别转移敏感性为23–64%，联合检测敏感性为74%，SQSTM1特异性高达92%。三种蛋白表达与颈部淋巴结转移、远处转移和临床分期成正相关。此外，ERP72 、SPTBN1表达水平与NPC淋巴结转移及临床分期有关，与病人年龄、性别无关。SMAC/DIABLO及CALR在鼻咽癌组织中表达未见明显差异。BSP测序发现MT2A、ANXA6在NP69中未发生甲基化，而在5-8F和6-10B中均出现不同程度甲基化。研究证明SPTBN1、PEBP1、CALR、AKAP12 及TGFBI、PDIA4、PTRF在鼻咽癌细胞中表达水平降低不能用基因启动子区域甲基化解释，而MT2A、ANXA6在鼻咽癌细胞中表达差异可能与该基因启动子区域甲基化相关。项目研究结果初步揭示了部分差异蛋白DNA异常甲基化在NPC发生与转移中的作用及临床价值，有望成为鼻咽癌发生及转移标志物。