基于适配子靶向病毒蛋白的策略研究HCV导致肝癌的机制与规律

Hepatitis C Virus (HCV) and its associated hepatocellular carcinoma (HCC) are still a major health problem wordwide. HCV-Core/NS4B proteins are reported closely related to HCC, while HCV-E2 envelope glycoprotein is closely related to HCV infection. However, most studies reported used viral gene over-expressed viral proteins to detect their effects on cell proliferation, cell cycle and tumor-suppressors. HCV infectious cell culture model is little used. Animal HCV infectious model is even less used. Moreover, antibodies which used in study are difficulty entering into the alive cell and targetting viral proteins inside the cells, so it is still needed to further understand viral proteins associated tumorgenesis at protein levels. However small molecular aptamer ""antibody" can enter into cells and target viral proteins inside of cells. In the previous work, the applicant (Prof. Zhang) has invented HCV-E2 glycoprotein aptamer through CS-SELEX and found this E2-aptamer could significantly inhibit HCVcc infection in the Huh7.5.1 cells. However, it is not known whether this E2-aptamer can inhibit HCV infection in vivo yet. Based on the applicant's experiences in HCV infectious cell culture model and viral pathogenessis, and her expertise of developing, validating, and implementing aptamers, including HCV-E2 glycoprotein aptamers for basic and translational studies, this study is proposing to bring the applicant's unique background and expertise to further better understand, prevent, and treat HCV-associated HCC and the viral proteins induced tumor immune escape by using aptamers "antibody" strategy to target HCV-NS4B/Core/E2 inside or ouside of cells both in vitro and in vivo.

丙型肝炎病毒-HCV 的E2糖蛋白与病毒感染、HCV-Core和NS4B蛋白与肝癌发展密切相关。 但大部分研究采用过度表达的病毒蛋白对细胞增殖和肿瘤抑制蛋白的作用，用HCV感染细胞模型研究还很少，动物感染模型则更少；且一般制备的抗体难以进入活细胞内靶向结合病毒蛋白, 在体内外活细胞内蛋白水平上，人们对胞内病毒蛋白致癌机制还了解不够，而小分子适配子具有能进入活细胞内靶向病毒蛋白的一些独特优势。申请者前期采用CS-SELEX技术已获得HCV-E2糖蛋白的适配子，E2适配子能特异性抑制HCV结合感染肝细胞，但是其在动物感染模型中是否有抑制能力还不清楚。该课题拟进一步验证E2适配子，以及新筛选NS4B和Core蛋白适配子, 在HCV感染活细胞及动物模型和整体水平，阐明HCV蛋白与宿主细胞相互作用机制及其在肝癌发生中的致病机制，并发掘病毒适配子在HCV及相关肝癌诊断与治疗中的新功能。

丙型肝炎病毒-HCV的E2糖蛋白与病毒感染、HCV-Core和NS4B蛋白与肝癌发展密切相关。但大部分研究采用过表达的病毒蛋白研究对细胞增殖和肿瘤抑制蛋白的作用，用HCV感染细胞模型研究还很少，动物感染模型则更少；且一般抗体难以进入活细胞内靶向结合病毒蛋白，在体内外活细胞内蛋白水平上，人们对胞内病毒蛋白致癌机制还了解不够，而小分子适配子具有能进入活细胞内靶向病毒蛋白的独特优势。本课题拟筛选和验证HCV-E2、NS4B等适配子，在HCV感染活细胞及动物模型和整体水平，阐明HCV蛋白与宿主细胞互作机制及其在肝癌发生中的致病机制，并发掘病毒适配子在HCV及相关肝癌诊疗中的新功能。.项目成功筛选获得针对HCV E2和NS4B蛋白的有效适配子，并阐明HCV-E2与宿主细胞互作机制及其在肝癌发生中的致病机制以及ApoE3介导病毒免疫逃逸新机制（中国病原微生物学杂志(2015), J Immunol (2014)，被Faculty of 1000和MDLinx列为推荐文章）；采用荧光标记的HCV-E2适配子ZE18在HCV的小鼠感染模型中靶向示踪HCV，为研究HCV动态感染提供了新手段(Biochim Biophys Acta, 2015)，并建立了基于HCV E2特异性适配子方法可用于丙肝诊断；首次在RNA病毒-HCV中发现core-RNA G四链体-G4结构，发现靶向HCV core G4的配体可通过稳定G4结构，抑制HCV的复制和蛋白翻译表达，成果发表在Science子刊Science Advances (2016)；筛选获得了肝癌细胞特异性DNA适配子，可作为循环肿瘤细胞(CTC)诊断工具用于肝癌肿瘤早期诊断(Anal Methods, 2014; Talanta, 2015)。发现HCV感染肝细胞后，肝癌细胞蛋白岩藻糖基化等N-糖基化明显增高，进一步研究发现FUT8糖基转移酶上调促使ANXA2和HSP90B1岩藻糖基化修饰增加，该成果为丙肝和肝癌诊疗提供的新靶标(Biochim Biophys Acta, 2017)；发现HCV的N-糖链介导的免疫逃逸新机制以及N-糖基化突变DNA疫苗(Biochim Biophys Acta, 2015)。本项目的成果为丙肝及相关肝癌诊疗提供了新手段，并为进一步阐释HCV与宿主细胞互作机制及其在肝癌发生中的致病机制提供了新方向。