MLH1增强子区域SNVrs143969848通过CTCF影响结肠癌MLH1基因表达的机制研究

Lynch syndrome is the most common inherited disorder, which presents with a much higher incidence of colorectal cancer than the population. It's mainly caused by the loss of function of a germline mutation in one of the mismatch repair(MMR) genes(MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2). However, 30% of patients with a clinical suspicion of Lynch syndrome, no mutations were identified in the coding region of the MMR genes. Our preliminary studies have identified a rare single nucleotide variant (SNV) at the upstream of MLH1 gene where enriched with active enhancer markers. This SNV was also located at a highly conserved CTCF binding motif, suggesting it may affect the MLH1 enhancer function by disrupting CTCF binding. Our study will use a series of molecular techniques to demonstrate the pathogenicity of this SNV in LS, showing that it would inhibit the MLH1 gene expression by affecting the interaction between MLH1 enhancer and promoter which was facilitated by CTCF. The better understanding of MLH1 gene regulation is of great clinical significance, which will provide new insight into the diagnosis and treatment of Lynch syndrome.

林奇综合征(LS)是一类最常见的遗传性结直肠癌，该类病人发生结直肠癌的概率明显高于正常人群。该疾病主要是由于错配修复基因(MLH1, MSH2, MSH6和PMS2)的种系突变而致错配修复功能缺失造成。临床上约30%的病人，尽管根据其家族史和肿瘤史高度怀疑LS，但在错配修复基因的编码区中却未找到致病的突变。本课题组在前期研究中对疑似LS的患者进行筛查，发现在MLH1基因上游的增强子标记的富集区域存在一单核苷酸变异(SNV)rs143969848，该SNV位于高度保守的CTCF结合位点上，提示其可能通过影响CTCF结合改变MLH1增强子的调控功能。本课题拟从细胞和动物水平阐明该SNV导致LS的作用机制：揭示其可能通过影响与CTCF转录因子的结合而阻碍MLH1增强子与启动子的相互作用进而抑制MLH1基因的表达。本课题对MLH1基因调控分子机制的探索会为LS提供新的诊治思路，有重要临床意义。

林奇综合征(LS)是一类最常见的遗传性结直肠癌，该类病人发生结直肠癌的概率明显高于正常人群。该疾病主要是由于错配修复基因(MLH1, MSH2, MSH6和PMS2)的种系突变而致错配修复功能缺失造成。临床上约30%的病人，尽管根据其家族史和肿瘤史高度怀疑LS，但在错配修复基因的编码区中却未找到致病的突变。本课题组在前期研究中对疑似LS的患者进行筛查，发现在MLH1基因上游的增强子标记的富集区域存在一单核苷酸变异(SNV)rs143969848，该SNV位于高度保守的CTCF结合位点上，提示其可能通过影响CTCF结合改变MLH1增强子的调控功能。本项目在既往研究以及预实验基础上，采用分子学实验的方法，主要获得以下研究结果：1）MLH1基因上游35kb区域仅在MLH1表达的细胞株中特异性与MLH1基因启动子相互作用，同时该区域检测到活化增强子的组蛋白修饰标志H3K4me1仅特异性在高表达MLH1的SW620结肠癌细胞株中富集。采用荧光素酶报告系统(LRA)检测到在稳定转染的K562和SW620细胞株中该区域可显著提高MLH1启动子的活性，提示其具有增强子功能；2）通过LRA和CRISPR功能试验，检测增强子区域的SNVrs143969848可引起内源性的MLH1 基因转录水平下，提示可能引起MLH1基因调控的异常，从而影响错配修复蛋白的功能；3）通过CHIP和CRISPR功能试验证实，SNV rs143969848可通过改变增强子区域与CTCF 的结合从而影响MLH1基因转录水平的调控，提示该CTCF区域的完整性对MLH1-35增强子区域的活性有至关重要的作用。MLH1基因调控机制的进一步的认识，对林奇综合征的发病机制，诊断和治疗提供了新的干预手段和靶点，具有重要的临床意义。