活性维生素D调控卵巢癌MLH1基因的表观遗传学机制研究

Ovarian cancer is one of the gynecologic cancers with the highest fatality rate and minimum 5 years survival rate. Our preceding study found that as an important member of DNA mismatch repair system , MLH1, protein expression was decreased, because of its promoter methylation and it play a key role in the occurrence and drug-resistance in ovarian cancer. However, the epigenetic regulation mechanism remains unclear. Active 1, 25 (OH) 2D3 involved in the regulation of tumor related gene by removal of histone methylation and DNA methylation. Our preliminary experiment found that different concentration of 1, 25 (OH) 2 D3 can inhibit the ovarian cancer SKOV3 cell growth, and in a time-dose dependent. Thus we propose the hypothesis that 1, 25 (OH) 2 D3 modulates the expression of MLH1,though histone methylation or DNA demethylation, eventually ,the level of MLH1 elevated. In this program we use human ovarian cancer cells and carcinoma in nude mice, using laser microdissection , confocal laser and vivo imaging in vivo to explore fine epigenetic mechanism of active vitamin.D regulating MLH1 in vitro and in vivo. We hope we could provide new targets of the occurrence and drug resistance in ovarian cancer.

卵巢癌是病死率最高和五年生存率最低的妇科恶性肿瘤。MLH1是DNA错配修复系统的重要成员，我们前期研究发现在卵巢癌中存在MLH1启动子甲基化，其蛋白表达下降，与卵巢癌的发生与耐药有重要关系，但是其表观遗传学调控机制不明。活性维生素1,25(OH)2D3能通过去除组蛋白甲基化及DNA甲基化作用参与到肿瘤相关基因的调节。我们预实验发现不同浓度1,25(OH)2D3对卵巢癌SKOV3细胞生长有抑制作用，并呈时间剂量依赖性。因此我们提出假说1,25(OH)2D3很可能通过组蛋白/DNA去甲基化作用，引起组蛋白H3K27去甲基化，使MLH1重新表达。本课题拟采用人卵巢癌细胞和荷癌裸鼠，利用激光显微切割，激光共聚焦及动物活体成像等先进技术，从体内体外分别探讨活性维生素D对MLH1的精细表观遗传学调控机制，为卵巢癌的发生及耐药提供新的靶点。

研究背景及内容:卵巢癌是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤,易对化疗药物顺铂产生耐药,而大量流行病学研究发现,维生素D缺乏可以作为癌症风险因素,将它与其他药物联用，能扩大其抗癌作用。因此，我们研究卵巢癌细胞系中，1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞的作用,对顺铂化疗敏感性的影响,探讨其可能的调控机制.材料和方法：1.用MTT,EDU染色,集落成形、划痕实验,Hochest3334染色和流式细胞仪观察1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞的功能学及顺铂耐药性的影响。2.用WesternBlot检测各组耐药相关蛋白（BRCA1，EZH2及H3K27me3，MLH1）和凋亡相关蛋白(P73，P53，Caspase-3，Caspase-9),VDR。3.下调EZH2后1,25(OH)2D3对耐药性及相关蛋白的影响，4.经1,25(OH)2D3处理后,EZH2及let-7e的表达情况。5，CHIP观察let-7e是否与VDR相结合。6，下调let-7e,WB和qRT-PCR检测EZH2的表达水平。7.建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察不同给药组皮下瘤生长情况,并用免疫组化检测瘤中EZH2、VDR和H3K27me3的表达水平,原位杂交检测let-7e的表达，TUNEL检测细胞凋亡情况。结果:1，随着浓度和作用时间的延长,1,25(OH)2D3对卵巢癌细胞增殖的抑制作用增强，对迁移没有明显作用，能促进细胞凋亡。2，1,25(OH)2D3联用顺铂能增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，促进凋亡,其凋亡率分别为：37.83%±6.28%和13.93%±0.23%。3.联用与单独顺铂相比,BRCA1、MLH1、P53升高,而EZH2、H3K27me3降低。其中1,25(OH)2D3介导的EZH2,H3K27me3下调,VDR,let-7e上调,具有时间和浓度依耐性。4.ChIP结果显示VDR能直接结合于let-7e的启动子区。下调let-7e,1,25(OH)2D3下调EZH2的作用可被减弱。5.裸鼠在体实验结果显示：与顺铂组相比,联合组瘤体体积减小、EZH2、H3K27me3的表达减弱,VDR增强；原位杂交和TUNEL结果显示联合组较顺铂组let-7e表达升高,细胞凋亡表达信号增强。结论：1,25(OH)2D3可能通过激活let-7e下调EZH2,从而增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,促进卵巢癌细胞的凋亡。