基于膜蛋白表位印迹的肿瘤靶向脂质体递药系统研究

表位印迹是通过合成蛋白表面裸露的线性多肽，将其作为印迹模板，所得印迹聚合物能识别整体蛋白的方法。该方法未考虑线性多肽脱离整体后结构多变的问题，若用于识别表位具有固定结构的细胞膜蛋白，则面临困难。本项目将多肽结构模拟与表位印迹相结合，拟以多种肿瘤高表达的膜蛋白p32为识别对象，合成p32胞外区N端序列。在此基础上通过内酰胺键修饰来模拟其细胞膜上实际结构，将所得多肽的末端经酸敏感键连接脂肪链"锚定"于脂质体上并开展表面印迹，获得表面经修饰（二氧化硅"包衣"）并含p32识别位点的靶向脂质体；进一步开展脂质体表面印迹并同时载药的研究，以期达到：递药系统特异性识别靶细胞、能有效抑制肿瘤生长、所载药物释放可控、生物相容性良好。分子印迹技术在肿瘤主动靶向递药领域具有良好的应用前景，但膜蛋白印迹方法欠缺是其应用的瓶颈，本项目对这一问题的探索研究将为膜蛋白识别和肿瘤靶向递药系统设计提供有益的思路。

分子印迹是针对特定模板分子“量身订做”与其形状、大小等相匹配的空穴结构，所得含空穴结构的聚合物（印迹聚合物）能特异识别该模板分子的一种技术。若将一类重要疾病靶标—膜蛋白作为印迹模板分子，则有望构建一类全新的主动靶向递药系统。然而，基于分子印迹识别膜蛋白及其递药研究面临两大难点：一、膜蛋白的难于获得、结构复杂等性质限制了常规印迹方法的使用，而针对膜蛋白末端线性序列进行印迹（表位印迹）则难以实现高亲和力的特异结合；二、印迹聚合物是相对封闭的体系，若印迹时同时载药，药物或位于聚合物浅表，易在除模板时亦被除去，或被禁锢于聚合物深处，难以释放而无法发挥药效。本项目为此进行了积极探索。 针对难点一，提出全新的“构象表位印迹”策略，即：首先选择膜蛋白胞外区末端具有特定结构的序列（构象表位）为拟印迹对象；鉴于直接将该序列“剥离”易失去原有结构，进一步选择含相同二级结构的多肽为“嫁接”模板，将构象表位上关键氨基酸嫁接到模板多肽上形成一条新的多肽；该多肽与膜蛋白构象表位在结构和关键序列上高度相似，以该全新多肽为印迹模板所得印迹聚合物能特异性结合目标蛋白。项目以肿瘤膜蛋白p32为模板，具体以其胞外区N端阿尔法螺旋区为识别对象，选择具有相同结构的蜂毒明肽为嫁接模板开展构象表位印迹，所得印迹聚合物纳米粒对p32具有纳摩尔级的高亲和力，并在细胞及体内水平显示出良好的靶向性。若采用序列相同但不具有相似结构的线性多肽为印迹模板，所得纳米粒无明显的靶分子识别能力，这进一步验证了构象表位印迹策略。针对难点二，提出两种全新的解决方法。一是基于表面修饰二氧化硅的脂质体开展表面印迹、脂质体内载药，所得脂质体表面含有印迹位点可有效识别靶蛋白，而二氧化硅层在生理中性条件下逐渐脱落以释放药物；二是将分子印迹与光动力治疗创新结合，光动力药物无需“释放”即可发挥药效。项目制备的载光动力药物印迹纳米粒经静脉给药后有效富集于肿瘤并在特定波长激光激发下显著抑制皮下瘤生长。将靶标膜蛋白的多肽配体（导向分子）修饰于载体表面以介导靶向治疗是肿瘤主动靶向递药的重要策略，该策略面临多肽体内稳定性的限制。本项目中，多肽首次 “间接”介导靶向递药，所形成的印迹位点具有高度稳定性。项目研究为靶向递药和膜蛋白识别提供了全新思路，有望进一步用于拮抗靶蛋白的聚合物药物研究（drug-free polymeric therapeutics)