lncRNAs调控羊绒生长的表观遗传学机制研究

Cashmere is the fine undercoat produced by the secondary follicle in the skin of cashmere goat. It has important economic value in husbandry industry. The growth of cashmere is affected by many kinds of factors, including light and temperature. In general, lncRNAs (long non-coding RNAs) are considered as non-protein coding transcripts longer than 200 nucleotides. The important function of lncRNAs is to mediate epigenetic changes by methylation, histone modification and gene imprinting to specific genomic loci. There is no report on lncRNAs regulating cashmere growth on epigenetic levels until now. The purpose of the project is to screen the specific lncRNAs invovling skin tissue development in different stages of Shanbei cashmere goat using lncRNA sequencing technology. The target genes of the specific lncRNAs will be verified by RNA immunoprecipitation and dual-luciferase reporter assay, and their methylation modes of lncRNAs regulating gene expression will be constructed by analyzing the methylation status of target genes. This is the first time to study the imprinting genes in goat. The expression rules of imprinting genes will be studied. So the growth mechanism of cashmere will be elaborated from the aspects of lncRNA epigenetic regulation, which will reveal the molecular mechanism of cashmere growth and provide reference for the further breeding work of cashmere goat.

羊绒是皮肤次级毛囊产生的纤细底层毛，具有重要的经济价值。其生长受光照和温度等环境因素影响较大。长链非编码RNAs（lncRNAs)是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200nt的RNA分子。lncRNAs的重要功能是通过甲基化、组蛋白修饰及基因印迹等途径在表观遗传层面上调控基因的表达。目前关于lncRNAs表观调控羊绒生长的研究尚未见报道，因此本项目以陕北白绒山羊为研究对象，拟筛选lncRNA-seq获得的不同胎儿发育阶段及羊绒生长期和休止期皮肤组织中特异lncRNAs，通过RNA免疫沉淀技术及双荧光素酶报告系统验证其靶基因；分析靶基因的甲基化水平，构建特异lncRNAs调控基因的甲基化表达模式；首次对绒山羊的印迹基因进行研究，绘制印迹基因在不同发育时期皮肤组织中的表达图谱，从表观遗传学角度阐述lncRNAs在羊绒生长中的调控机制，揭示羊绒生长的分子机理，为绒山羊进一步的育种工作奠定基础。

本研究的目的在于通过对不同胎儿发育时期及羊绒生长期和休止期皮肤组织中lncRNAs的表达及其靶基因甲基化分析，探讨羊绒生长的表观遗传机制。通过对羊绒生长期和休止期皮肤组织差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA的联合分析，构建了lncRNA-miRNA-mRNA的调控网络，并对lnc-000552对毛乳头细胞增殖及其诱导功能进行了深入研究，发现该lncRNA具有促进毛乳头细胞增殖的功能，而且干扰该lncRNA后，毛乳头细胞的诱导功能降低；通过对绒山羊65胚龄和120胚龄皮肤组织转录组测序及全基因组甲基化分析，发现全基因组范围内120胚龄皮肤约有1.78%的胞嘧啶（C）发生了甲基化（mC），在65胚龄约有1.97%的C发生了甲基化。65胚龄期更高的甲基化水平表明：甲基化参与调控胚胎发育时期皮肤及皮肤附属器官如毛囊的发育过程。全基因组甲基化与转录组的联合分析结果表明，不同时期的差异表达基因受DNA甲基化水平的调控，而且lncRNA LNC_002056和LNC_00374等参与调控靶基因的甲基化水平。由于在测序中发现多个角蛋白家族成员及角蛋白相关蛋白在生长期的表达量显著高于休止期，而Hoxc13的表达量具有与之相同的趋势，因此我们对Hoxc13对不同角蛋白基因的调控机制进行了研究，结果表明Hoxc13对KRT38和KRT84启动子具有显著的正调控作用，而对KRT1与KRT2启动子具有负调控作用。另外，我们采用3D培养技术对体外培养的次级毛囊细胞添加不同浓度的褪黑素，结果发现500 ng/L褪黑素能够促进次级毛囊毛干的生长，通过lncRNA-seq发现，差异表达的基因有170个，而且富集到与毛囊周期性变化的两个重要通路Focal adhesion和ECM；lncRNA TCONS_00255106 与 TCONS_00206163可能通过其靶基因THBS2、COL4A2而参与褪黑素对毛干生长的调节。该项目系统探究了lncRNA在绒山羊绒毛毛囊发生及周期发育中的功能及其可能的机制，阐述了DNA甲基化参与绒山羊胚胎发育时期毛囊发生的调控，进一步联合分析发现了lncRNA可能通过调控靶基因甲基化参与毛囊发生的过程。同时我们对筛选的关键功能基因、lncRNA及miRNA开展了相关的功能研究。以上研究丰富了绒山羊毛囊发生及绒毛周期发育的调控机制，为绒山羊的育种工作提供理论支持。