用于快速细胞成像的多通道拉曼成像技术及仪器开发

Raman imaging technique plays an important role in the field of cell and medical imaging, due to its advantages of high specificity, non-label and low aqueous interference. However，Raman signal of the cell research system given in short scan time is too weak with low SNR, so the real-time live cell imaging puts high demands on the time-resolution capability of Raman imaging. If multi-channel imaging data can be achieved by wide-field mode and reconstructed to the complete Raman spectra, the time-resolution capability of Raman imaging will be promoted significantly. We aims at fast cell Raman imaging: 1) Establish fast multi-channel Raman imaging instrument, achieve the multi-channel data by wide field mode using optical filters and array CCD, and develop the corresponding control software; 2) Establish complete Raman spectrum reconstruction method, develop the calibration-reconstruction algorithm, establish the sample database and ensure the reliability of the reconstructed spectra; 3) Establish the fluorescent background elimination method for multi-channel data, on the basis of the traditional fluorescence elimination algorithms, introduce the normalization and least squares algorithms to further improve the Raman imaging quality. The smooth implementation of project will improve the time resolution capability of Raman imaging technique by reducing the Raman imaging time significantly, and provide insights for the study of cell, medical science and pathology.

拉曼光谱因具有特异性高、无标记和不受水干扰等优点，在细胞和医学成像中发挥越来越重要的作用。然而，细胞体系拉曼信号微弱，短时间采谱意味着信号信噪比低，因此活体细胞的在线实时成像对拉曼成像技术的时间分辨能力提出了较高的要求。如能利用多通道宽场模式获取成像数据，并通过重建算法估计完整的拉曼光谱，将显著提高拉曼光谱成像技术的时间分辨能力。本项目拟以快速细胞拉曼成像为目标：1）开发快速多通道拉曼成像仪器，以宽场模式激发样品，结合滤光片组合和面阵CCD获得多通道数据，并开发相应的控制软件；2）建立完整拉曼光谱的重建方法，开发标定-重建算法，并建立样品的光谱数据库，保证重建光谱的可靠性；3）建立多通道数据的荧光背景消除方法，在传统荧光消除算法的基础上，引入归一化和最小二乘算法，从而进一步提高拉曼成像质量。项目的顺利实施将能显著降低拉曼成像时间，提高其时间分辨率，为细胞、医学和病理学研究提供依据。

针对拉曼成像技术在动态性能方面的需求，同时也为了提高对活体细胞拉曼成像的实时性，本项目考虑到宽场成像模式在时间分辨方面的优势，开发了多通道拉曼成像仪器及其相应的信号和数据处理方法，同时开展了相关验证实验。研究的主要内容如下：（1）搭建了一种低成本、能够实现快速多通道拉曼成像的硬件系统，开发了光路、电路和机械装置，达到了预期的各项性能指标；（2）开发了专属本仪器的，基于全局加权线性回归、样本优化和PCA、核熵成分分析等的拉曼光谱标定-重建算法，实现待测样品多通道窄带响应的快速标定及完整拉曼光谱的重建；（3）在拉曼信号处理方面，开发了基于快速傅里叶变换、经验模态分解和人工智能的通用型去噪和去基线方法，有效地提高了成像的清晰度；（4）在图像处理方面，提出了适用于本仪器拉曼成像图像的插值算法，能够在一定程度上提高图像的分辨率，同时开发了全自动的图像缺陷识别和修复算法；（5）开发了专用的多通道拉曼成像软件平台，通过 C#、C++与 Matlab 多语言混合编程实现了Windows 应用程序，实现了各项硬件的驱动控制和协同工作，并集成了本项目开发的所有算法；（6）在实验验证方面，实现了整机的测试，并开展了单组分、多组分和活体细胞的多通道拉曼快速成像实验，获得了预期的成像效果，也验证了仪器和算法的性能。本项目的研究，以宽场模式实现了数据的快速采集，并使用所开发的标定-重建算法获得完整拉曼光谱从而实现成像，该技术及所开发的仪器能够显著降低拉曼成像时间，提高其时间分辨率，可以为细胞、医学和病理学研究提供依据，同时对于大批量药品生产的拉曼成像检测也有一定的应用价值。