盐藻中磷酸化转录因子对盐胁迫的分子响应

本项目拟采用IMAC技术、二维凝胶电泳技术及HPLC技术，分离盐胁迫条件下盐藻细胞核的磷酸化蛋白质；质谱技术鉴定磷酸化转录因子并确定磷酸化位点；应用生物信息学手段研究磷酸化转录因子作用的靶基因及互作蛋白，通过靶基因的表达分析鉴定转录因子的功能，从而揭示盐胁迫信号在细胞内传递的分子途径及基因表达的调控机制。该项研究深入到细胞内的生物活性分子以及这些分子在微观环境中的相互作用，从微观的角度真实地反映出盐藻细胞适应高盐环境的本质，丰富和发展了现有理论，具有重要的科学意义。同时也为人们有效地控制基因，培育耐盐植物新品种，解决目前面临的农业、生态环境等重大问题提供理论依据，具有重要的应用价值。

盐藻（Dunaliella salina）是己知最耐盐的真核生物，能够在0.05～5.5 mol/L NaCl的培养液中生长、繁殖，是研究植物抗盐分子机制最理想的模式生物。本研究以盐胁迫下盐藻细胞核磷酸化蛋白质表达谱的变化以及差异表达蛋白的基因转录水平为切入点，采用亚细胞分离、IMAC及电泳技术，分离盐胁迫下盐藻细胞核的磷酸化蛋白质组；质谱技术鉴定磷酸化转录因子；生物信息学分析转录因子的磷酸化位点、三维结构和功能；采用RT-PCR和RACE技术克隆差异表达蛋白的基因，实时荧光定量PCR技术分析差异基因在盐胁迫条件下的表达模式。本研究从差异表达蛋白的改变、基因调控水平两个方面，揭示高盐胁迫对盐藻的毒性效应及特定功能蛋白和基因对盐藻生命过程的调控机制，具有重要的理论和经济利用价值。.结果如下：.1.建立盐藻细胞核的分离技术、核磷酸化蛋白质组的富集、分离和鉴定方法。分离鉴定出29个蛋白质家族共计217种蛋白质，包括蛋白激酶、膜蛋白、离子通道蛋白、小G-蛋白和热休克蛋白等。质谱鉴定及生物信息学分析表明，在217个蛋白质中，磷酸化蛋白质有93个，占被鉴定蛋白的43%，定位在细胞核中的蛋白质有11个家族共计133种，占被鉴定蛋白总数的61%；其中 ihfA， hrcA，areA， H2AZ，hsf1，RUVB2和rex 1为磷酸化转录因子。.2.克隆了4个参与盐藻耐盐胁迫的关键基因：DsSTPK基因（GenBank登录号：JN625213）、DsMAPK基因（(GenBank登录号：JQ782412)、CDPK基因（GenBank登录号：JQ964113）及小G蛋白基因（GenBank登录号：JN989548），生物信息学方法分析了这些基因所表达蛋白的理化性质、亚细胞定位、二级结构和三级结构等；构建系统进化树发现，盐藻和衣藻、团藻亲缘关系最近。实时荧光定量PCR技术分析DsMAPK、DsMAPK、CDPK及小G蛋白基因的表达情况，发现4个基因表达均受高盐胁迫诱导，在高盐(3M)胁迫下表达量明显上调，与正常对照组相比，差异极显著(P<0.01)。说明这4个基因在盐藻对盐胁迫反应中起重要作用，是参与盐藻耐盐胁迫的早期快速反应基因。.3.国内外杂志发表论文6篇，其中SCI收录2篇，国内核心期刊2篇，接收2篇。在GenBank注册基因序列4个、蛋白质序列4个。培养硕士生9名。.