杜氏盐藻PKC在盐胁迫信号传导中的功能研究

The research is carried out through the molecular response mechanism of Protein kinase C（PKC）signal pathway in Dunaliella salina induced by salt stress. Combining cross-disciplines method, molecular biology, proteome, computational biology and bioinformatics, will be used to systemically study the function of PKC in response to salt stress. The clone and functional analysis of PKC genes will be obtained using RT-PCR, RACE, QRT-PCR, and RNAi.The subcellular location and translocation of PKC proteins will also be investigated using fusion report gene mapping method.The interacting proteins in PKC signal regulation network will be screened by Co-immunoprecipitation assay and Yeast Two Hybrid System.Using simulation methods of bioinformatics, molecule linkage and molecule dynamics,we will reveal their interacting pattern.Finally the signal transduction by PKC pathway and protein expression controlling mechanisms to high salinity could be revealed by signal pathway network.The research focuses on location and shift of PKC related proteins in signal transduction pathway, interaction between these proteins and signal network. The aim of our research is to deeply illuminate molecular mechanism of PKC signal pathway of Dunaliella salina induced by salt stress. It is important to reveal the role of PKC gene and PKC related signal pathway network of Dunaliella salina induced by salt stress at the proteomics level. This will provide new thinking and new approach for the study of molecular mechanism of Dunaliella salina in response to stress. This study has both scientific significance and application values.

本项目针对盐藻蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC)信号途径在盐胁迫下的分子响应，拟采用分子生物学、蛋白质组学、计算生物学和生物信息学等多学科交叉的手段，系统研究盐藻PKC在抗盐胁迫中的功能。采用RT-PCR、RACE及实时荧光定量PCR技术克隆PKC基因，分析基因表达模式及其调控规律；RNAi技术鉴定PKC基因的功能；融合报告基因定位法确定PKC的亚细胞定位及移位情况；应用免疫共沉淀、酵母双杂交以及蛋白质组学的方法筛选PKC信号调控网络中的互作蛋白；利用分子对接和分子动力学模拟方法研究PKC与靶分子间的调控模式，构建盐藻PKC信号调控网络。本项目对细胞内典型的信号转导通路PKC途径进行系统深入的研究，探讨PKC基因及其信号调控网络在盐藻抗逆胁迫中的作用，从蛋白质组学水平揭示盐藻抗逆防御的分子机理，为阐明盐藻耐盐的分子机制提供新思路和新途径，有重要科学意义和经济利用价值。

盐藻（Dunaliella salina）是公认的能够耐受高盐的低等真核生物，是研究植物耐盐生理机制的最理想模式生物。本研究采用RT-PCR和RACE技术获得了盐藻PKC基因；qRT-PCR和RNAi技术分析基因的表达模式及功能；融合报告基因定位法确定PKC的分布及移位情况；应用酵母双杂交、免疫共沉淀及多组学技术系统地研究盐藻响应盐胁迫的分子信号途径。本研究从基因及蛋白质组学水平揭示盐藻抗逆防御的分子机理，为阐明盐藻耐盐的分子机制提供新思路和新途径，具有重要的科学意义和经济利用价值。.取得如下成果：.1. 获得了盐藻蛋白激酶C基因。生物信息学分析表明，该蛋白为非跨膜蛋白，具有保守的蛋白激酶催化区，ATP结合区（167-175），催化活性区（293-305），是一种催化组蛋白丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化的蛋白激酶；通过分子对接、动力学模拟以及试验验证该蛋白激酶属于PKC家族的经典PKC亚型；应用qRT-PCR和RNAi技术证明其为盐诱导上调基因，在盐藻对盐胁迫的应答反应中起到重要作用；克隆了盐藻PKC基因和绿色荧光蛋白基因GFP，成功构建了亚细胞定位表达载体。利用融合报告基因定位法明确了盐藻PKC分布于细胞质和膜上，盐胁迫时由细胞质向膜转移。.2.构建了盐藻均一化SMART cDNA文库、Y187酵母文库及诱饵表达载体，通过酵母双杂交方法鉴定到2种互作蛋白质；构建了原核表达载体，获得高纯度融合蛋白，制备了多克隆抗体，通过免疫共沉淀及 LC-MS/MS技术，共鉴定出差异蛋白78种；运用iTRAQ技术鉴定出盐藻差异表达蛋白质141个，其中盐胁迫上调75个，下调66个。.3. 采用高通量测序技术对盐藻在盐胁迫下的转录组、小RNA组和降解组进行了分析。转录组测序获得了显著性差异表达基因2760个；小RNA组测序在盐藻中首次发现1008种miRNA基因，显著性差异表达miRNA有49种。降解组测序验证了194个盐藻miRNA的745个靶基因。筛选出6种miRNA在盐藻应答高盐胁迫的渗透调节过程中发挥重要作用。.4. 国内外杂志发表论文12篇，其中SCI收录4篇（录用2篇），国内核心期刊3篇（录用1篇）。转录组序列注册到NCBI-SRA数据库（PRJNA471570），蛋白质序列注册到PRIDE数据库（PXD010739）。培养硕士生11名。