珠眉海棠转录因子MzWRKY调控盐胁迫响应的分子机理研究

盐害是影响苹果生产的重要因素，盐胁迫响应机制的阐明将为苹果的分子育种提供依据。珠眉海棠（Malus Zumi）是分布在东北地区的耐盐苹果砧木，项目组对珠眉海棠进行了耐盐鉴定，并通过组织培养快繁了鉴定后的珠眉海棠。WRKY是近年来发现的关键盐响应转录因子，它调控响应的分子机理尚待揭示。申请人已从珠眉海棠中克隆了耐盐基因MzWRKY并初步验证了它的功能。本项目在此基础上，通过根癌农杆菌和发根农杆菌转化珠眉海棠，获得超表达MzWRKY和表达沉默的转基因植株。再根据转基因植株的转录组的数据，筛选随MzWRKY的上调、下调而表达变化的基因，通过生物信息学的分析和功能预测的再次筛选后，进行RT-PCR 初步验证并克隆候选下游基因。通过瞬时和稳定的共表达试验确认上、下游基因间的调控关系，同时通过凝胶阻滞电泳判断是否存在直接的调控关系，揭示MzWRKY调控盐应答的分子机理。

项目基本按原计划进行，全部完成了项目计划的工作。从耐盐品种珠美海棠（Malus zumi Mats）中分离和克隆参与盐胁迫应答的 MzWRKY 基因。获得了超表达MzWRKY9的转基因植株，通过chip-seq筛选出受到MzWRKY9基因调控的下游基因。通过chip-PCR和EMSA，分别进行了体内和体外的验证，进一步证明MzWRKY9 直接调控WD1、WD2、WD3、WD4、WD5等。同时，在体内原位的瞬时转化系统中证明，MzWRKY9抑制的WD1、WD2、WD3表达。结果如下：.1 本实验从珠美海棠中克隆了11个MzWRKY 基因的开放阅读框，分别为MzWRKY1、MzWRKY3、MzWRKY9、MzWRKY10-1、MzWRKY10-7、MzWRKY11、MzWRKY17、MzWRKY22、MzWRKY25、MzWRKY39、MzWRKY40。MzWRKY1、MzWRKY17和MzWRKY22属于第Ⅰ类WRKY转录因子；MzWRKY9、MzWRKY11、MzWRKY25和MzWRKY39属于第Ⅱ类WRKY转录因子；MzWRKY10-1、MzWRKY10-7、MzWRKY3和MzWRKY40属于Ⅲ类WRKY转录因子。.2 检测了这11个MzWRKY转录因子的转录活性。酵母系统的检测结果表明，MzWRKY3、MzWRKY10-1、MzWRKY17、MzWRKY25和MzWRKY40具有转录激活活性；原生质体系统的检测结果表明，MzWRKY9表现为转录抑制。.3 在拟南芥中超表达了MzWRKY9、MzWRKY10-1、MzWRKY10-7、MzWRKY11、MzWRKY17、MzWRKY22、MzWRKY25、MzWRKY39、MzWRKY40等基因, 获得了转基因阳性植株。超表达MzWRKY9转基因拟南芥幼苗对盐胁迫敏感；超表达MzWRKY11和MzWRKY17转基因拟南芥幼苗均对盐敏感。.4在超表达MzWRKY9的嘎啦转基因材料中，通过chip-seq筛选出受到MzWRKY9基因调控的下游基因。通过chip-PCR和EMSA，分别进行了体内和体外的验证，进一步证明MzWRKY9直接调控WD1、WD2、WD3、WD4、WD5等。同时，在体内原位的瞬时转化系统中证明，MzWRKY9抑制WD1、WD2、WD3的表达。