珠眉海棠中“MAPK级联通路”磷酸化“转录因子MzWRKY6”调控盐胁迫响应的分子机制

Salt stress decreases the apple production severely. The molecular breeding of salt-tolerant apple rootstock is an efficient way to increase apple production in salinized soil. After years of research on the salt-tolerant apple rootstock Malus zumi Mats, we cloned a key transcription factor MzWRKY6 playing a central role in response to salt stress. The over-expression of MzWRKY6 conferred transgenic apple rootstock M26 plants enhanced salt tolerance. The candidate genes directly regulated by MzWRKY6 were screened out by ChIP-Seq. In addition, the possible interaction between MzWRKY6 and MzMAPK3, MzMAPKK4 and MzMAPK3 were found by yeast two-hybrid and BiFC. Based on these results, in both the in vivo and in vitro systems, the up-stream MAPK cascade phosphorylating MzWRKY6 and the down-stream genes directly regulated by MzWRKY6 under salt stress will be revealed. Our research will systematically reveal the complete salt stress response pathway, in which 'MAPK cascade' pass on the salt stress signal to MzWRKY6 and affect its regulation of downstream genes for the physiological adaption to salt stress. Our research will contribute to efficient molecular apple rootstock breeding.

盐胁迫严重影响苹果生产，通过分子育种培育耐盐砧木，是在盐渍化土壤中提高苹果产量的有效手段。项目组从耐盐苹果砧木珠眉海棠中，发掘出响应盐胁迫的关键转录因子MzWRKY6，并成功转化苹果砧木M26，超表达MzWRKY6提高了M26的耐盐性。并初步用ChIP-Seq分离了MzWRKY6直接调控的候选下游基因。通过酵母双杂和BiFC技术，获得了可能调控MzWRKY6的MAPK级联成员MzMAPK3和MzMAPKK4。而盐胁迫下，MzMAPKK4/MAPK3如何通过磷酸化MzWRKY6，进而调控靶基因的表达，响应胁迫并不清楚。本项目将在体内、外系统中，确认MzWRKY6上游的MAPK通路、受MzWRKY6直接调控的靶基因，确认磷酸化对盐胁迫下MzWRKY6结合靶基因启动子、调控其表达的作用。揭示以MzWRKY6为节点的盐胁迫响应机制，发掘关键调控因子和靶基因，为耐盐分子育种提供理论依据和基因资源。

盐胁迫的信号传递是植物盐胁迫应答的核心问题，转录因子在信号传递通路中处于中心位置，起承上启下的关键作用。本项目筛选到苹果中两个响应盐胁迫的WRKY转录因子(MdWRKY9 和MzWRKY11)，并深入探究其耐盐机理。盐胁迫处理下，超表达 MdWRKY9 的转基因植株和愈伤的耐盐性显著强于对照 M26 植株和愈伤。ChIP-qPCR、EMSA、qPCR 等试验发现 MdWRKY9 可以在体内和体外直接结合 MdNHX4 的启动子，抑制 MdNHX4 的表达，从而降低液泡对K+的区隔化，因此提高转基因植株和愈伤的耐盐性。我们发现 MdWRKY9 在体内存在磷酸化。MdWRKY9 可以和 MdMAPK6 互作，MdMAPK6 可以和 MdMAPKK9 互作。体外磷酸化试验证明 MdWRKY9 可以被 MdMAPKK9/MdMAPK6 级联磷酸化。瞬时转化愈伤进行 ChIP-qPCR 和GUS 染色试验证明，MAPK 对于MdWRKY9 的磷酸化可以进一步增强MdWRKY9 结合 MdNHX4 启动子的能力，抑制 MdNHX4 的表达。超表达MzWRKY11提高了转基因苹果植株和愈伤的耐盐性，RNA干扰MzWRKY11植株和愈伤耐盐性下降。在盐胁迫下，超表达MzWRKY11的转基因植株中K+:Na+比值显著高于对照。体内ChIP-qPCR和体外EMSA的结果表明，MzWRKY11可以结合3个液泡膜上的Na+/H+反转运蛋白基因（MdNHX1、MdNHX2和MdNHX3）的启动子，这一结合促进了K+向细胞内的转运及Na+的外排和区隔化，从而能够提高转基因苹果植株的K+:Na+比值，增强耐盐性。.综上所述，我们的研究深入解析了苹果转录因子MdWRKY9 和MzWRKY11参与耐盐的机理，为揭示苹果属植物的盐胁迫应答机理提供依据。