Cthrc1与TGF-β、Smad的双向调控对瘢痕疙瘩发病机理研究

Fibroblasts play an important role in the pathogenesis of keloid. The regulation balance of the TGF-βand Smad signal pathway is one of the critical factors for the proper proliferation of fibroblasts. Recent researches showed Cthrc1 could regulate the synthesis of collagen I and III. Evidence from the reseaches abroad and our own data showed there was relationship between Cthrc1 with TGF-βand Smad. The expression of TGF-β1 and Cthrc1 were significantly increased in mRNA and protein level in fibroblasts from keloid compared with normal skin. TGF-β1can induce the expression of thrc1 in a dose dependent pattern. Recombinant Cthrc1 can inhibit the expression of type I collagen induced by TGF-β1.In this study we will use gene transfect, siRNA interference techniques and luciferase reporter vector system to investigate if exists a bilateral regulation loop between Cthrc1 with TGF-βand Smad and their possible mechnism in the proliferation of fibroblasts in keloid which possibly supplies new ideas for the pathogenesis and theratheupic strategy of keloid.

成纤维细胞的过度增生在瘢痕疙瘩的发生中发挥重要作用，而TGF-β及Smad信号的调节平衡是成纤维细胞适度增生的主要因素之一。国外最近研究表明Cthrc1能调节胶原I和III型的合成，国外研究及我们的预试验显示Cthrc1与TGF-β及Smad之间存在一定的关联，在瘢痕来源的成纤维细胞中TGF-β1及Cthrc1 在mRNA和蛋白表达水平与正常皮肤来源的成纤维细胞中比较均显著增加，TGF-β1可诱导Cthrc1的表达，而且Cthrc1 的表达增加与TGF-β1呈浓度依赖性,重组Cthrc1可以抑制TGF-β1诱导的I型胶原的表达。我们拟采用基因转染和siRNA干扰技术以及荧光素酶报告系统研究在瘢痕疙瘩成纤维细胞的增生中Cthrc1 与TGF-β及Smad之间是否存在双向调节环路以及调控机制，为阐明瘢痕疙瘩的发病机理和治疗提供新的思路。

目的：瘢痕疙瘩虽然是一种良性肿瘤，但对患者的生活质量带来了极大的影响。胶原三螺旋重复蛋白-1（Collagen triple helix repeat-containing protein 1，Cthrc1）首先在气球样变的动脉管壁成纤维细胞中发现，可抑制胶原的的沉积。本研究探讨了Cthrc1在瘢痕疙瘩中的作用及相关作用机制。.方法：分别收集瘢痕疙瘩、正常皮肤的新鲜组织标本，采用荧光定量PCR、蛋白质印迹、免疫组织化学法等方法检测Cthrc1、YAP组织水平的表达情况。同时对Cthrc1、YAP在成纤维细胞中的表达水平进行检测。采用慢病毒感染的方法使正常成纤维细胞（NFs）和瘢痕成纤维细胞（KFs）的Cthrc1表达升高。采用CCK-8、Transwell的方法，检测Cthrc1的增高对两种成纤维细胞在细胞增生活性、迁移能力的影响。定量PCR、Western blot、细胞免疫荧光法分别检测Cthrc1对Ⅰ型胶原、TGF-β通路蛋白和YAP表达定位情况的影响。最后，TGF-β1刺激NFs和KFs观察Cthrc1的变化情况，探讨两者之间的关系。.结果：Cthrc1在瘢痕疙瘩组织中及瘢痕成纤维细胞中表达升高，且主要表达于瘢痕成纤维细胞的胞浆内。与NFs相比，YAP在KFs的胞浆及胞核内均有的表达。KFs的细胞增殖率及迁移率较NFs显著升高。当升高正常成纤维细胞Cthrc1的表达后，NFs的增殖率及迁移率也增高。而且Cthrc1的增加降低了NFsⅠ型胶原的表达同时促进了YAP的表达及向核内转移，此外，Cthrc1还抑制了NFs细胞的p-Smad2/3的核内转移。然而，当增加KFs中Cthrc1的表达后，KFs的迁移率反而降低同时细胞增殖率无明显变化。与NFs相同的是增加Cthrc1可降低KFs的Ⅰ型胶原表达并抑制p-Smad2/3向核内转移。但不同的是Cthrc1降低了KFs的YAP表达并抑制了YAP的核转移。在NFs和KFs中，TGF-β1均可促进Cthrc1的表达。.结论：在瘢痕疙瘩发展过程中，Cthrc1可通过增加YAP的表达及促进YAP的核转位激活正常的成纤维细胞，同时通过降低YAP的表达和抑制YAP向核内转移使瘢痕成纤维细胞活性降低。此外，Cthrc1作为TGF-β通路的负反馈因子通过抑制p-Smad2/3核转移降低Ⅰ型胶原的合成。Cthrc1可能促进了正常的创