靶向TGF-beta Ⅱ型受体的核酸适配子对TGF-beta介导LOX过度表达的抑制作用研究

Glaucoma is the second commonly encountered eye disease leading to blindness. Filtration surgery can effectively decrease the IOP by enhancing the drainage of aqueous material and is the principal treatment for glaucoma. However, the soaring occurrence of subconjunctival scarring that blocks the surgically created drainage channel limits the success rates of this surgery. The myofibroblast transdifferentiation and excessive crosslinking of extracellular matrix after surgery are two main reasons leading to subconjunctival scarring. TGF-beta could induce the overexpression of LOX in cell or tissue after surgery. The overexpression of LOX causing the excessive crosslinking of extracellular matrix leading to scarring. In our previous study, we screened aptamers targeted againstthe extracellular domain of T βRII and derived a dominant sequencecalled aptamer S58 that antagonised TGF-beta-induced transdifferentiation of human Tenon's capsule fibroblasts into myofibroblastsin vitro. However, the shortage of S58 in the chronergy is existing. We wonder that if S58 could inhibit scarring by inhibiting the excessive crosslingking of extracellular matrix. In this study, the expression of LOX in HTFs and the influence on LOX expression by TGF-beta will be studied for the first time. Then, the intervention effect of S58 on TGF-beta-induced LOX overexpression and the related signaling pathways will be observe. Finally, the chronergy of S58 inhibiting scarring will be observed after rat filtration surgery. By the studying of this topic, we will further improve the efficacy and mechanism exploration of a novel anti-scarring aptamer drug S58 after glaucoma surgery.

青光眼是人类第二大致盲性疾病，手术降低眼压是主要治疗方法，但滤过术后结膜瘢痕形成是手术失败的主要原因之一。术后成纤维细胞转分化和细胞外基质过度交联是瘢痕化形成的两个主要原因。术后TGF-beta诱导组织细胞过度表达赖氨酰氧化酶（LOX）家族，LOX引起细胞外基质的过度交联导致瘢痕化。本课题组前期筛选到靶向TGF-betaII受体适配子S58已被证实可抑制成纤维细胞转分化，但在时效上存在不足。设想，S58是否还可通过抑制细胞外基质过度交联作用的途径抑制瘢痕形成呢？在本项目中，我们将对LOX在人Tenon's囊成纤维细胞中的表达情况以及TGF-beta对LOX表达的影响进行研究；观察S58对TGF-beta诱导LOX过度表达的干预作用，初步探究相关信号通路；并在大鼠抗青光眼模型上观察S58抑制瘢痕化的时效性。通过本项目，进一步完善抗青光眼术后瘢痕化药物S58的功效和机制研究。

青光眼是人类第二大致盲性疾病，手术降低眼压是主要治疗方法，但滤过术后结膜瘢痕形成是手术失败的主要原因之一。术后成纤维细胞转分化和细胞外基质过度交联是瘢痕化形成的两个主要原因。术后 TGF-beta 诱导组织细胞过度表达赖氨酰氧化酶（LOX）家族，LOX 引起细胞外基质的过度交联导致瘢痕化。本课题组前期筛选到靶向 TGF-betaII 受体适配子 S58已被证实可抑制成纤维细胞转分化，但在时效上存在不足。设想，S58是否还可通过抑制细胞外基质过度交联作用的途径抑制瘢痕形成呢？在本项目中，我们将对 LOX 在人Tenon's 囊成纤维细胞中的表达情况以及 TGF-beta 对 LOX 表达的影响进行研究；观察 S58对 TGF-beta 诱导 LOX 过度表达的干预作用；并在大鼠抗青光眼模型上观察 S58 抑制瘢痕化的时效性。通过本项目，进一步完善抗青光眼术后瘢痕化药物 S58的功效和机制研究。.通过本项目的研究结果发现LOXs表达于人眼 Tenon’s 囊成纤维细胞中； TGF-β2 可促进人眼 Tenon’s 囊成纤维细胞中 LOXs 蛋白的表达，且呈现一定的浓度和时间依赖性。 S58 可明显抑制 TGF-β2 诱导 HTFs 表达 LOXs 蛋白的分泌。通过细胞实验进一步筛选具有阻抑作用的适配子，并将筛选的适配子 S58应用壳聚糖凝胶包被，应用该凝胶包被核酸适配子，在体外检测凝胶的包被率及适配子的缓释效应。通过构建大鼠青光眼滤过术（glaucoma filtration surgery，GFS）模型，分别用 TGF-β2、MMC、壳聚糖凝胶（CS）和 CS/S58 凝胶处理球结膜瓣，应用裂隙灯及 AS-OCT 观察滤过泡的形态及存活时间，监测眼压变化，狼红染色观察手术区胶原纤维的沉积；Western blot 及组织免疫化学染色检测手术区结膜组织表达 Collagen I、α-SMA 情况，检测组织的炎症反应及细胞增殖与凋亡情况。壳聚糖温敏凝胶可有效的包被适配子 S58，体外持续缓释长达 1 mo，累积缓释率达84%；CS/S58 凝胶可抑制大鼠滤过术后结膜组织炎性反应，显著抑制Col I、α-SMA表达以及胶原纤维沉积，滤过泡生存时间显著延长，提示 CS 凝胶联合适配子 S58 对结膜瘢痕的抑制效应明显强于单独 CS 凝胶的作用，有望为青光眼术后抗瘢痕治疗提供新