靶向TGF-beta Ⅱ型受体胞外段适配子改构及其抑制青光眼滤过泡瘢痕形成的研究

青光眼是世界上第二大致盲性眼病，手术降低眼压是主要治疗方法，但滤过术后结膜瘢痕形成是手术失败的主要原因之一。TGF-beta在结膜瘢痕形成中有重要作用，而与TGF-betaⅡ型受体结合是其发挥生物学效应的关键步骤，封阻该受体可以抑制TGF-beta致纤维化作用。我们采用SELEX技术已经筛选到靶向TGF-betaⅡ型受体的两类适配子，并在体外实验中证实S58具有抑制成纤维细胞增殖的作用，三维模建工具推测出S58与蛋白质氨基酸残基可能发生交互作用的残基位点。本项目拟在此基础上，通过生物信息学方法进一步分析该适配子与TGF-betaⅡ受体蛋白的结合位点和结合力，通过受体胞外段片段突变或点突变的方法，在体内外实验中验证适配子生物学效应；并在生物信息学分析的指导下对该适配子进行改构，探索发挥最佳封闭效果的最短适配子序列。为降低组织纤维化的发生，提高抗青光眼滤过术的成功率提供实验依据。

青光眼是世界上第二大致盲性眼病，手术降低眼压是主要治疗方法，但滤过术后结膜瘢痕形成是手术失败的主要原因之一。TGF-beta在结膜瘢痕形成中有重要作用，而与TGF-betaⅡ型受体结合是其发挥生物学效应的关键步骤，封阻该受体可以抑制TGF-beta致纤维化作用。我们采用SELEX技术已经筛选到靶向TGF-betaⅡ型受体的两类适配子，并在体外实验中证实S58具有抑制成纤维细胞增殖的作用，三维模建工具推测出S58与蛋白质氨基酸残基可能发生交互作用的残基位点。本项目拟在此基础上，通过生物信息学方法进一步分析该适配子与TGF-betaⅡ受体蛋白的结合位点和结合力，通过受体胞外段片段突变或点突变的方法，在体内外实验中验证适配子生物学效应；并在生物信息学分析的指导下对该适配子进行改构，探索发挥最佳封闭效果的最短适配子序列。为降低组织纤维化的发生，提高抗青光眼滤过术的成功率提供实验依据。 .我们的研究发现：核酸适配子ssDNA S58及TβRⅡ胞外段蛋白结合的可信位点包括位点I（T4、T5、G6、C7）、位点Ⅱ（G13、A14、T15、C16、G17、C18）、位点Ⅲ（T31、G32、T33、C34）及位点Ⅳ（G40、A41、T42、T43、T44、G45、G46）。S58及TβRⅡ胞外段蛋白的亲和力高，S58的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达明显较DMEM 对照降低（P＜0.05），根据结果剪切适配子S58后得到优化后的ssDNA亲和力、α-SMA表达均不如S58。结果说明核酸适配子S58为受体蛋白TβRⅡ的高特异性分子，具有一定稳定性，任何结构的改变均会降低与TβRⅡ的亲和力。.我们另辟途径，引入了高分子材料壳聚糖，作为S58载体，期望达到提高S58稳定性及生物利用度的目的。研究发现：S58经壳聚糖纳米微粒包裹后，表现出良好的血清稳定性，稳定的缓释特性等特性，在血清存在的条件下CS(S58)-NP较S58具有更稳定的生物活性，可在12到48小时时间段持续抑制TGF-β2介导的HTFs转分化作用。制成壳聚糖温敏凝胶后，可抑制大鼠滤过术后结膜组织炎性反应和细胞增殖，显著抑制Col I、α-SMA表达以及胶原纤维沉积，滤过泡存活时间显著延长，维持良好的滤过泡形态，CS凝胶联合适配子S58对结膜瘢痕的抑制效应明显强于单独CS凝胶的作用，有望为青光眼术后抗瘢痕治疗提供新的思路。