LILRA3基因对炎症性肠病患者NK细胞与单核巨噬细胞功能的影响

Our large sample Immunochip study has shown that LILRA3 gene rs410852 locus were strongly associated with CD, and further study showed that expressions of LILRA3 in CD and UC were higher than that in control group. Our present project aims: 1)to genotype LILRA3 gene polymorphisms (rs410852 and rs103294) in IBD patients and healthy controls by TaqMan/MGB probe to find out the differential genotype and haplotype. 2)to investigate the effects of LILRA3 genotype or haplotype on LILRA3 mRNA and protein expressions by site-directed mutagenesis, DLR and EMSA. 3)to isolate NK cells and mononuclear macrophages in lamina propria and peripheral blood from IBD patients, to knock-out or knock-in LILRA3 to detect the effects of NK cells on degranulation and cytotoxicity and the phagocytosis of macrophages, and then to detect the expressions of mRNA, microRNA and lncRNA. 4)Moreover, to compare the phenotypic features and functions of NK cells and macrophages in different LILRA3 genotypes. Taken together, to understand effects of LILRA3 gene or genotype on its expression, the phenotypes and functions of the NK cells and mononuclear macrophages, and to clarify its functions in IBD pathogenesis.

我们前期通过大样本IBD患者的immuno-chip研究证实LILRA3基因rs410852位点与CD相关，且CD和UC患者LILRA3蛋白表达较对照组显著增高。本项目研究进一步：1）采用TaqMan/MGB探针法验证LILRA3基因的rs410852和rs103294位点与IBD的相关性，筛选具有差异的基因型和单倍型。2）采用定点突变、DLR和EMSA等技术研究LILRA3基因型对其mRNA和蛋白表达水平的影响。3）分离IBD患者外周血和肠粘膜固有层NK细胞和单核巨噬细胞，沉默或过表达LILRA3基因，检测细胞杀伤、毒性作用和吞噬功能，并检测mRNA, micorRNA和lncRNA表达。4）比较不同基因型NK细胞和单核巨噬细胞的表型特征和功能。通过上述内容探讨LILRA3基因及基因型对其表达、NK细胞和单核巨噬细胞表型特征和功能的影响，以及这种影响在IBD发病中的作用。

我们前期通过大样本炎症性肠病（IBD）患者的Immunochip研究证实LILRA3基因位点突变与克罗恩病（CD）相关，且CD和溃疡性结肠炎（UC）患者LILRA3蛋白表达较对照组显著增高。研究过程中我们发现，ZMIZ1和TP53基因与LILRA3基因存在明显连锁不平衡，首先对ZMIZ1（rs1250569位点）、TP53（rs1042522位点）多态性与IBD相关性进行研究；分析其基因型-表型相关性，以及对LILRA3表达的影响。纳入179例CD患者、202例UC患者及517例健康对照者（HC），进行测序，分析基因型分布及基因型-表型相关性。研究结论，ZMIZ1基因是中国汉族人群IBD的易感基因，其基因型与CD表型有相关性。再检测ZMIZ1基因在IBD患者、HC、和IBD小鼠模型外周血、肠粘膜中mRNA、蛋白表达情况。结果发现，ZMIZ1在IBD患者外周血和肠黏膜中，以及IBD鼠模型中mRNA、蛋白水平的表达也增多，说明ZMIZ1在IBD发病中发挥作用，可能成为新的治疗靶点。ZMIZ1主要在腺上皮胞质和黏膜固有层单个核细胞核中表达，提示ZMIZ1基因可能通过影响细胞功能参与IBD发病。.国际最新研究表明，LILRA3基因6.7-kb剪切多态性相对于单核苷酸多态性与自身免疫性疾病相关性更加密切，但与IBD发病机制相关性仍然不明。LILRA3主要在单核细胞中表达，但LILRA3多态性对单核细胞生物特性的影响缺乏系统性研究。我们纳入378例IBD患者和509 健康对照者，进行基因测序，并对IBD患者血液和肠粘膜中LILRA3 mRNA、蛋白和免疫组化表达进行检测，结果发现LILRA3在IBD患者中表达明显增加。在体外实验，我们在人U937细胞系建立了LILRA3过表达模型，结果发现LILRA3过表达的单核细胞产生更少的干扰素(IFN-γ), 肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-6)等炎性因子。突变的LILRA3通过减少多种趋化因子及其受体的产生损伤了单核细胞的迁移能力。LILRA3能够增加CD36的表达导致单核细胞的吞噬能力增强。并且，LILRA3通过影响Akt和MEK/Erk信号通路增加单核细胞增殖。本研究是证实了LILRA3基因与我国IBD患者发病的正相关性，并在体外实验中证实LILRA3基因通过单核细胞来对机体炎症进行负调节。