亚细胞蛋白组学筛选HHD高尔基体差异蛋白及其功能研究

家族性良性慢性天疱疮是一种常染色体显性遗传大疱性皮肤病，该病临床表型差异很大，究其原因不只是突变引起单一蛋白改变所致，而应是导致的蛋白质组改变引起。本课题在前期研究的基础上，采用高尔基体亚细胞蛋白质组学和生物信息学的方法，检测患者与正常人皮肤角质形成细胞培养体系、皮肤类似物模型中角质形成细胞高尔基体差异蛋白，寻找发病中的关键蛋白，并进行差异蛋白验证和功能研究，意欲阐明蛋白表达的差异，探讨基因型和表型之间的联系，从细胞亚单位水平阐述HHD发病的可能分子路径，为本病的诊断、有效治疗和产前咨询奠定基础。

本研究提取HHD患者体内基因组DNA，利用PCR技术扩增ATP2C1基因外显子序列后，通过基因测序技术和生物信息学技术共发现：无义突变R799X 和S212X，错义突变R417K、D644G和K866T，移码突变356fs2X，剪接突变118-2A＞G，其中6个突变国内外尚未报道。同时，检测无义和错义两型突变HHD患者体内ATP2C1基因的转录和翻译水平，采用Realtime-PCR技术和HIC染色发现，患者血液中ATP2C1基因mRNA表达和皮肤组织中hSPCA1蛋白表达较正常水平均明显降低，从而证实半倍剂量不足理论是这两种突变的共同作用机制，还发现同家族中临床症状严重的患者其体内ATP2C1基因mRNA表达较症状轻者降低更明显，而与错义突变相比无义突变的患者基因mRNA表达水平降低更明显，甚至低于正常人水平的50%。此外，通过分离和培养人体原代角质形成细胞，并采用RNA干扰技术抑制ATP2C1基因表达模拟突变影响后发现：经RNA干扰48h后ATP2C1基因mRNA表达水平明显下降，而伴随着基因编码的hSPCA1蛋白降低同时细胞内p63蛋白表达也明显降低，结果与HHD患者皮肤组织中p63检测结果一致，由此证实ATP2C1基因突变将影响p63蛋白的表达，造成细胞发育和分化的异常是HHD可能的致病机制。