肝纤维化治疗新靶点RPS5及其分子机制研究

Our previous studies have found that matrine derive M19 exhibits potent antifibrotic effects and specifically binds to ribosomal protein S5 (RPS5). RPS5 siRNA has been demonstrated to significantly enhance AKT activation and aggravate experimental hepatic fibrosis induced by DMN and BDL. Conversely RPS5 overexpression inhibits liver fibrosis in vitro and in vivo through suppression of AKT activation. Further, RPS5 interacts with p-AKT, but not AKT. In addition, our data also reveal that M19 increases cellular RPS5 protein and inhibits AKT activation. Moreover, RPS5 siRNA markedly reduces inhibitory effects of M19 on hepatic stellate activation, indicating that M19 displays its action, at least in part, through binding to RPS5. Altogether, these results suggest that RPS5 may be a therapeutic target for hepatic fibrosis. This project will validate the role of RPS5 in the pathological process of liver fibrosis using RPS5 knockout mouse, investigate the molecular mechanisms involved in its inhibition of AKT activation, and probe the binding sites of RPS5 with AKT. Meanwhile, M19 will be studied in parallel. Results will reveal whether RPS5 may function as a target for drug interference and clarify the molecular mechanism of M19 for its antifibrotic effects.

我们研究发现具有抗肝纤维化活性的甲氨基硫代苦参碱(M19)特异结合核糖体蛋白RPS5。采用基因过表达和RNA干扰技术体内外证明RPS5siRNA促进AKT活化，加重DMN和BDL诱导的大鼠肝纤维化，相反，过表达RPS5则抑制AKT活化，减轻肝纤维化。免疫共沉淀进一步发现RPS5结合p-AKT。此外，还发现M19能增加RPS5蛋白水平和抑制AKT活化，而RPS5siRNA则减弱M19抑制肝星状细胞的活化作用，表明RPS5是M19的细胞内靶点。上述结果提示RPS5是肝纤维化治疗的新靶点。本项目拟采用RPS5基因敲除小鼠对RPS5在肝纤维化病理进程中的作用进行确证，研究RPS5抑制AKT活化的分子作用机制，并初步探讨RPS5的结合位点，同时平行研究M19的作用。研究结果将为肝纤维化治疗提供新的靶点，揭示RPS5作用的分子机制，同时阐明M19的分子作用机制。本研究是前期工作的延续和深入。

我们前期研究发现具有抗肝纤维化作用的苦参碱衍生物M19能够特异性结合核糖体蛋白 RPS5。采用基因过表达和RNA干扰技术体内外证明 RPS5 siRNA 促进 AKT 活化，加重DMN和BDL诱导的大鼠肝纤维化，相反，过表达RPS5则抑制AKT活化，减轻肝纤维化。此外，还发现 M19 能增加 RPS5 蛋白水平和抑制AKT活化，而RPS5 siRNA则减弱M19抑制肝星状细胞（HSC）的活化作用，表明 RPS5 是 M19 的细胞内靶点，同时也是肝纤维化治疗的新靶点。基于该研究基础，本项目继续探索HSC选择性敲减RPS5对肝纤维化的影响，深入阐明RPS5作用的细胞机制。我们构建了以HSC特异性启动子GFa2为启动子的RPS5干扰腺病毒，分别在体内和体外证实选择性敲减HSC的RPS5水平能够促进HSC的活化和肝纤维化发展进程。同时，我们构建了HSC条件性敲除RPS5的基因敲除小鼠（RPS5 Flox/Flox / GFAP-Cre+），发现该小鼠较对照小鼠体型小，体重约为对照小鼠的1/3，体弱，肝重指数约为对照小鼠的73%，肝脏细胞增殖受阻。研究结果表明RPS5是肝脏正常生长所必需的基因，也是肝纤维化重要的易感基因，是设计抗肝纤维化药物的潜在靶点。机制研究发现RPS5能够同p-AKT/AKT相互作用，作为新型AKT磷酸酶直接参与p-AKT脱磷酸化过程。由于RPS5的磷酸酶活性依赖于Mg2+、Mn2+等二价金属离子，对广谱磷酸酶抑制剂冈田酸不敏感，且RPS5具有结合金属离子的活性中心，因此，属于PP2C磷酸酶家族成员之一。而M19能够促进RPS5对p-AKT的脱磷酸化作用，是RPS5的激活剂。该研究阐明了RPS5调控肝纤维化的分子作用机制，深入论证RPS5作为肝纤维化治疗靶点的可能性，同时，明确了M19的分子作用机制，为抗肝纤维化药物的研究提供理论依据。这不仅是药物研究的创新，同时也是发现新的药物靶点的创新，具有重要的理论意义和应用前景。除此之外，我们还应用免疫共沉淀的方法寻找RPS5其他相互作用蛋白，结果发现在RPS5免疫共沉淀复合物中存在ERK、GSK3β以及p85等蛋白，同时RPS5对ERK及GSK3β的活化水平也具有调节作用，这些研究是RPS5功能研究的进一步延伸，仍然值得深入探索和研究。