商陆皂苷甲结合蛋白核糖体蛋白S3a调控NFkB信号转导通路的研究

前期发现商陆皂苷甲（EsA）通过阻断NFκB抑制炎性细胞因子发挥抗炎免疫调节作用。结题基金后续研究发现EsA能特异性结合核糖体蛋白RPS3a，而且RPS3a能调控NFkB转录活性。RPS3aSiRNA消除了EsA抑制NFkB的作用，提示RPS3a是一个调控NFκB信号通路的新组分。本项目拟以RPS3a为"诱饵"筛选RPS3a特异性结合的蛋白质（RPS3aBP）并通过实验确证；进一步研究RPS3aBP对NFkB信号转导过程的影响。同时平行研究EsA探针对RPS3a与RPS3aBP相互作用以及NFkB信号转导过程的影响，以期发现和鉴定NFκB信号转导网络的新组分，揭示RPS3a如何调控NFκB信号转导途径，同时阐明EsA的分子作用机制；另一方面，研究RPS3a与炎症免疫疾病的相关性或易感性关系，揭示RPS3a在炎症免疫性疾病发病中的作用。本项目是前期工作的创新和延续。

商陆皂苷甲（Esculentoside A,EsA）是从中药商陆（Phytolacca esculent Van Houte）的块根中提取的一种三萜皂苷类化合物，本研究旨在探讨EsA的抗炎机制，及其特异性结合蛋白RPS3a是否参与了炎症和免疫刺激信号的细胞内信号转导过程。结果发现，EsA抑制TNF-α刺激的Jurkat T细胞和LPS刺激的RAW264.7细胞内NF-κB及MAPK信号通路的活化，抑制炎症细胞因子TNFα和IL-8 mRNA表达和蛋白释放；亲和层析法和竞争结合实验证明EsA特异性结合RPS3a，表面等离子共振分析技术进一步证实EsA与RPS3a结合解离常数Kd值约为11.3 μM；RPS3a RNA干扰，可抑制LPS刺激的RAW264.7细胞表达促炎细胞因子TNFα和IL-6 mRNA和蛋白，抑制LPS刺激IκB磷酸化和降解，抑制LPS刺激的JNK、ERK和P38磷酸化，但对JNK、ERK和P38总蛋白无影响；表明RPS3a具有调节免疫反应的功能。免疫共沉淀结合质谱法进一步探讨RPS3a的作用机制，发现多聚腺苷酸结合蛋白（Pabpc1，4 和Pabpc1l2b）、热休克蛋白（Hspa1b，Hspa8和Hspa5）以及谷胱甘肽转移酶P1（GSTP1）等能与RPS3a结合。文献报道，多聚腺苷酸结合蛋白和热休克蛋白参与细胞因子mRNA稳定和快速降解，推测RPS3a通过结合多聚腺苷酸结合蛋白和热休克蛋白调控细胞因子mRNA表达。RPS3a RNA干扰不能进一步增强EsA的抑制作用。RPS3a过表达对TNF诱导的炎症因子产生和信号通路无影响，但可以逆转EsA的抑制作用。表明RPS3a参与EsA的抗炎作用。EsA结合RPS3a与多聚腺苷酸结合蛋白、热休克蛋白、谷胱甘肽转移酶P1的关系有待进一步研究。此外，本项目还研究了苦参碱衍生物M19抗炎抗肝纤维化作用及其分子机制。苦参碱衍生物体内外能显著抑制LPS诱导的炎症反应，抑制LPS刺激的RAW264.7细胞内NF-κB信号通路的活化。鉴定了RPS5为M19的细胞内靶点，发现RPS5具有调控炎症免疫反应和抑制肝星状细胞（HSC）活化的功能。M19通过稳定细胞内 RPS5水平抑制HSC活化。研究结果不仅进一步阐明了EsA和苦参碱衍生物抗炎抗肝纤维化作用机制，而且提出了RPS3a/RPS5可作为治疗炎症以及肝纤维化新靶点。