苦参碱衍生物结合蛋白RPS5作为肝纤维化治疗新靶点的研究

肝星状细胞（HSC）活化和上皮细胞间质转型（EMT）在肝纤维化中起重要作用。我们新合成的苦参碱衍生物13-甲氨基-18-硫代苦参碱(M19)能抑制HSC活化和逆转EMT过程，体内抗肝纤维化活性显著，可能与其特异结合核糖体蛋白RPS5有关。核糖体蛋白具有调控基因转录等核糖体外的新功能，但RPS5与肝纤维化的研究尚为空白。本项目将研究HSC活化和肝细胞EMT过程及实验诱导的肝纤维化模型中RPS5的表达变化；采用RPS5过表达/RNA干扰技术，在细胞和整体动物水平上研究RPS5调节HSC和肝细胞功能及对肝纤维化病理进程的影响；并用免疫共沉淀和基因芯片技术分析RPS5相互作用蛋白及信号通路，同时阐明M19以RPS5为靶点抗肝纤维化的分子机制。已有部分结果证实RPS5在肝纤维化中起重要作用。本研究将揭示RPS5在肝纤维化中的作用机制，为其治疗提供新的靶点，并为M19应用于抗肝纤维化治疗奠定理论基础。

肝纤维化是各种病因所致慢性肝损伤的修复反应，其主要特征是细胞外基质的过度沉积。在纤维化形成过程中，肝星状细胞的活化和上皮细胞-间充质转化的发生发挥了至关重要的作用。研究表明肝纤维化是一个可逆的过程，因此，寻找并发现新的影响肝纤维化进程的作用靶点和抗肝纤维化药物对于肝纤维化的治疗具有重要意义。本课题组前期研究发现，经结构修饰的苦参碱硫代衍生物M19，其药理活性显著增强，对肝纤维化的治疗效果优于苦参碱。我们前期利用连续亲和色谱法、竞争亲和色谱法结合质谱鉴定等技术，确证了苦参碱及M19 的特异结合蛋白之一为核糖体蛋白S5。RPS5是真核生物核糖体40S小亚基的组成成分，主要参与蛋白质的加工与合成，此外它还有许多核糖体外的功能。目前，RPS5与肝纤维化的关系尚不清楚。本项目主要对RPS5与肝纤维化的关系进行探索。一是验证RPS5的表达与肝纤维化形成和发展的关系。实验发现在活化的肝星状细胞与肝纤维化动物模型的肝组织中，RPS5的表达明显下调；构建携带人源RPS5 基因的高表达腺病毒载体以及携带靶向大鼠RPS5基因的小干扰腺病毒，将其分别导入大鼠肝星状细胞HSC-T6，结果表明RPS5的下调促进了HSC-T6的活化及EMT进程，在体外确证了RPS5表达与肝星状细胞的活化存在密切的联系。之后再经尾静脉注射将病毒分别导入肝纤维化大鼠体内，结果证实RPS5表达减少可以促进肝纤维化进程，而RPS5上调可抑制肝纤维化过程，这一调节与HSCs活化和EMT进程相关。二是验证了RPS5可能介导苦参碱衍生物M19的抗肝纤维化作用。实验表明M19能够增加肝星状细胞内RPS5的水平；在RPS5存在条件下，M19可以减少HSC-T6细胞中α-SMA的表达，而RPS5干扰后，M19的作用消失，表明RPS5介导了M19对α-SMA及I型胶原表达的抑制作用。三是对RPS5可能的相互作用蛋白和信号通路进行了探索，发现RPS5可能通过参与调控Akt通路，影响肝纤维化的发生与发展。RPS5基因沉默提高了Akt的磷酸化水平，促进肝星状细胞活化和EMT进程，从而加剧肝纤维化；RPS5抑制Akt磷酸化是其抑制肝纤维化的重要作用机制，提示RPS5是肝纤维化治疗的新靶点。综上所述，本研究进一步解释了RPS5在肝纤维化中的作用机制，为其治疗提供新的靶点，并为M19应用于抗肝纤维化治疗奠定理论基础。