RAD6B在核苷酸剪切修复和皮肤肿瘤发生中作用的研究

Living cells will activate DNA damage response pathways to repair the damaged DNA. Defect of DNA damage repair results in genomic instability and mutations and cancer. we screened most of the known E2 enzymes and found that RAD6 function together with RNF168 in the ionizing radiation (IR)-induced DNA damage response. Moreover, the RNF168-RAD6 complex targeted histone H1.2 for ubiquitination. Recently，we found RAD6B-RNF168 complex play a role in nucleotide excision repair (NER) after ultravalet induced DNA damage. H1.2 didn't increased in Cytoplasm of RAD6B deficent cells after UV iradoation. The release of H1.2 to the cytoplasm is related with apoptosis by induce cytochrome c release. RAD6B may related with H1.2 release after DNA damage. In this study, we will explore the function of RAD6B in NER pathway. We will identify the exact ubiquitin site of H1.2 by RAD6B-RNF168 during NER repair. Futhmore, we will explore the function of RAD6B in H1.2 release form DNA and the relationship of this release to apoptosis. Also, we will explore the role of RAD6B in UV induced skin cancer and the function of P53 in this procces.

DNA损伤后细胞会启动相应的修复机制进行修复，修复功能的缺失会导致基因组的不稳定和突变的发生，从而导致肿瘤发生。DNA损伤后H1.2游离到细胞质并通过释放细胞色素c启动细胞凋亡。我们的前期工作证实了RAD6B和RNF168通过泛素化组蛋白H1.2在DNA双链损伤修复中发挥作用，最新又发现它们在紫外线损伤后的核苷酸剪切修复NER中也发挥作用，并且RAD6B基因缺失细胞在DNA损伤后游离到细胞质的H1.2量相对较对照细胞少。所以我们推测RAD6B和RNF168泛素化修饰H1.2可能与损伤后H1.2与DNA解离有关。本研究计划进一步探讨RAD6B在NER修复通路中的作用及其上下游关系；明确RAD6B和RNF168泛素化修饰是否与H1.2和DNA解离并传导凋亡信号到线粒体有关；通过基因敲除小鼠研究RAD6B在紫外线诱导皮肤肿瘤发生中的作用；探讨P53在RAD6B缺陷小鼠皮肤肿瘤发生中的作用。

细胞在内源性或外源性因素作用产生DNA损伤后，迅速启动相应的修复机制，而修复功能的缺失会引起基因组不稳定和突变，进而导致肿瘤发生。DNA损伤后，线粒体释放细胞色素C启动细胞凋亡。我们的前期工作证实了RAD6B和RNF168通过泛素化组蛋白H1.2参与DNA双链损伤修复和紫外线损伤后的核苷酸剪切修复，并且RAD6B基因缺失细胞在DNA损伤后游离到细胞质的H1.2量较对照细胞少。为了深入研究RAD6B和RNF168泛素化修饰H1.2与损伤后H1.2与DNA解离的关系。本研究以RAD6B缺陷的转基因小鼠和MEFS细胞为模型，首先探讨RAD6B在NER修复通路中的作用及其上下游关系，发现RAD6B缺陷引起下游BRCA1等修复蛋白在损伤位点的招募明显减弱，当野生型SBP-RAD6B转染阳性细胞射线照射后能够恢复 BRCA1在损伤位点的招募；进一步研究RAD6B和RNF168在NER通路中和其他E3和底物关系；在此基础上，构建了质粒GFP-H1.2，以研究RAD6B和RNF168泛素化修饰是否与H1.2和DNA解离并传导凋亡信号到线粒体有关，观察到了胞浆内游离H1.2的含量有微弱增加，从线粒体释放入胞浆的游离cyt.c的含量也有微弱增加；通过杂交RAD6B+/-P53+/-小鼠获得同窝的RAD6B+/+P53+/-、RAD6B-/-P53+/-小鼠，并加以紫外线照射诱导损伤，研究RAD6B和P53在紫外线诱导皮肤肿瘤发生中的作用，发现RAD6B缺失导致小鼠更容易形成鳞状细胞癌。综上所述，RAD6B通过泛素化修饰组蛋白参与NER，RAD6B缺失导致细胞DNA损伤修复缺陷和基因组不稳定性增加，更容易形成肿瘤。本研究不仅揭示了RAD6B参与NER以维持细胞基因组稳定性中的重要作用和机制，也为皮肤肿瘤的研究和治疗提供了新思路。