泛素连接酶RNF8在紫外线诱导的DNA损伤修复和皮肤肿瘤发生中作用的研究

Defect of DNA damage repair results in genomic instability and mutations and cancer. Using RNF8 knock-out cells and mice, we explored the role of RNF8 in DNA double strand breaks by ubiquitination of histones in our previous work. Moreover, we identified the high expression of RNF8 in bladder cancer cells. Knock down of RNF8 results in sensitizes bladder cancer to radiotherapy. More recently，we found RNF8 play a role in nucleotide excision repair (NER) after ultravalet induced DNA damage. The substrates of RNF8 are more than H2A. PTEN signaling system was depressed and the P53 was activated in RNF8 knock-out cells. In this study, we will explore the function of RNF8 in NER pathway. We will identify the exact ubiquitin site of substrats of RNF8. Futhmore, we will explore the function of PTEN and P53 in the pathway of NER. Also, we will explore the role of RNF8 in UV induced skin cancer and the function of P53 in this procces. we used in vivo and in vitro systems combined with clinical samples to investigate the mechanisms of RNF8 induced genomic instability and tumorigenesis, which could provide a new target for tumor diagnosis and treatment.

DNA损伤修复功能的缺失会引起细胞基因组的不稳定和突变的发生，从而导致肿瘤发生。我们的前期工作证实了RNF8通过泛素化组蛋白参与DNA双链断裂的损伤修复，缺失后导致神经元基因组不稳定；发现了RNF8在膀胱癌高表达，干扰RNF8可提高膀胱癌放疗敏感性。我们最近的工作证实RNF8在紫外线损伤后的核苷酸切除修复通路中也发挥作用，并且其泛素化底物不止H2A。CRISPR/Cas9敲除RNF8后通过全基因表达谱芯片检测和生物信息学分析发现了PTEN通路被明显抑制而P53基因明显激活。本研究计划进一步探讨RNF8在核苷酸切除修复通路中的作用及其上下游关系；明确RNF8泛素化修饰底物；探讨PTEN和P53在RNF8所在修复通路中的作用；通过基因敲除小鼠研究RNF8在紫外线诱导皮肤肿瘤发生中的作用；深入解析RNF8 网络调控基因组不稳定与诱导肿瘤发生的分子机制，为肿瘤的预防治疗提供新的靶点。

DNA损伤修复功能缺失会引起细胞基因组的不稳定和突变的发生，进而可能导致肿瘤的发生。本研究证实RNF8在紫外线损伤后的核苷酸切除修复通路中发挥重要作用，其机制在于泛素化修饰H2A、H1.2和除组蛋白以外的其他非组蛋白。我们在RNF8敲除的细胞和组织中检测底物蛋白和相应位点的泛素化修饰水平变化。通过点突变、蛋白表达、in vitro 泛素化体系研究相应位点泛素化水平在底物蛋白整体修饰中的比重。CRISPR/Cas9敲除RNF8后通过全基因表达谱芯片检测和生物信息学分析发现了PTEN通路被明显抑制而P53基因被明显的激活。本研究明确了RNF8和PTEN在核苷酸切除修复通路中的作用及其上下游关系；通过下调PTEN表达和下调P53观察对核苷酸切除修复和基因组稳定性的影响，以及通过紫外线诱导DNA损伤后观察比较对核苷酸切除修复通路的影响，明确了PTEN和P53在RNF8所在修复通路中的作用。下调RNF8和PTEN后细胞对UV损伤修复的时间都明显延长，并且，RNF8敲除后PTEN及PTEN信号通路被明显抑制，阐明了RNF8和PTEN都参与了核苷酸切除修复过程，并且PTEN在RNF8下游。通过UV照射和DMBA药物诱导方式，观察观察RNF8基因敲除小鼠以及RNF8和/或P53基因敲除小鼠皮肤肿瘤的发生情况，研究了RNF8和P53在紫外线和DMBA诱导皮肤肿瘤发生中的作用；通过泛素化修饰组学分析，筛选RNF8泛素化底物，挖掘泛素连接酶RNF8的泛素化底物和泛素化位点，深入解析了RNF8 网络调控基因组不稳定与诱导肿瘤发生的分子机制，我们观察到RNF8KO小鼠接种黑色素瘤的生长速度更快，瘤重比更高，以及浸润的淋巴细胞与免疫因子的数目都比WT小鼠少，通过筛选发现此现象与Gal-3表达关系密切，通过体内外实验证实了RNF8通过泛素途径调控Ggl-3影响到黑色素瘤肿瘤微环境，该分子机制为肿瘤的预防治疗提供新的靶点。通过收集人皮肤肿瘤临床病理标本和癌旁组织样本制作皮肤肿瘤组织芯片,初步判断RNF8与皮肤肿瘤发病、恶性程度及预后密切相关。