新水稻类病斑抗病基因LIL1的遗传互补与功能分析

Lesion mimic mutants (LMMs) which phenotype resemble hypersensitive response are used to reveal the mechanism of plants resistance. LIL1 is a lesion mimic mutant identified in an ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenized population of the Indica rice (Oryza sativa L. ssp. Indica) 93-11. Resistance-related genes were elevated in LIL1 which enhanced the resistance to rice blast (Magnaporthe grisea)evidently. Genetic analysis and fine mapping results showed that LIL1 is a novel LMM gene which controlled by a single dominant locus. Differential gene expression analysis and sequencing were proceed based on fine mapping which identified a Tyr receptor kinase-like protein gene as the candidate gene of LIL1. Full-length cDNA of the candidate LIL1 gene was obtained by RACE(rapid amplification of cDNA ends) and the overexpression plant transformation vector was constructed.. The purpose of this study was to verify lesion mimic phenotype is associated with mutant LIL1 cadidate gene by genetic complementation and analyse the function of LIL1 by autophosphorylation and dephosphorylation assays, spatiotemporal expression patterns test, subcellular localization experiment and yeast two-hybrid analysis. The results of the study will provide valuable insight into the control of HR and defense response pathways in plants.

植物类病斑突变体因其表现型与植物防卫反应中的过敏反应类似而被广泛应用于植物抗病机理的研究。我们从籼稻93-11的EMS诱变群体中鉴定出一个类病斑突变体LIL1，该突变体激活了水稻抗性相关基因的表达，并对稻瘟病菌的抗性显著增强。遗传分析和精细定位结果表明，LIL1是一个新的控制水稻类病斑表型的显性基因。在精细定位的基础上对候选区域内基因进行了表达差异分析和序列测定，确定LIL1编码一个类似Tyr受体激酶的蛋白。目前已通过RACE获得了LIL1候选基因的全长cDNA，并构建了超表达载体。.本研究将通过遗传互补试验验证LIL1突变基因与类病斑性状的关联，并体外证实LIL1蛋白的激酶活性，分析LIL1基因的时空表达特性，研究LIL1蛋白的亚细胞定位，通过酵母双杂交的方法寻找与LIL1互作的蛋白，在此基础上解析LIL1基因的相关分子生物学功能，为揭示植物抗病防卫反应及其网络信号调控提供重要信息。

植物类病斑突变体因其表现型与植物防卫反应中的过敏反应类似而被广泛应用于植物抗病机理的研究。前期研究从籼稻93-11的EMS诱变群体中鉴定出一个类病斑突变体LIL1，该突变体激活了水稻抗性相关基因的表达，并对稻瘟病菌的抗性显著增强。通过遗传分析和定位发现该基因是一个不完全显性基因，位于水稻第7染色体，是一个新的控制水稻类病斑表型的显性基因。在精细定位的基础上对候选区域内基因进行了表达差异分析和序列测定，确定一个类似Tyr受体激酶的蛋白基因为候选基因，并构建了超表达载体。. 本项目在前期研究的基础上，首先将构建好的超表达载体通过基因枪法成功转化到粳稻日本晴当中，获得了转基因阳性植株。经RT-PCR验证，LIL1基因在转基因植株中成功表达。然而，转基因阳性植株的类病斑表型不典型，与突变体植株的表型存在差异。鉴于LIL1基因来自于籼稻，不同的遗传背景可能影响基因的表达模式，我们将纯合的转日本晴阳性植株与籼稻特青进行了杂交（93-11未赶上花期），观察F1的表型，发现杂交后代的F1与LIL1突变体的杂合个体的表型类似，最终确定LIL1突变基因与类病斑性状的关联。在此基础上，我们对阳性转基因系进行了稻瘟病菌人工接种离体抗性鉴定，结果表明转基因系的稻瘟病抗性水平明显增强。用荧光定量的方法检测了LIL1野生型基因在籼稻93-11和粳稻日本晴中的时空表达特性，发现野生型LIL1基因在3叶期、抽穗期、灌浆期和成熟期的表达量显著升高，而突变体的LIL1基因在任何时期表达量都维持较高水平。稻瘟病菌可以诱导93-11中LIL1野生型基因的的表达。说明突变体类病斑的形成和LIL1基因的表达关系密切，且LIL1基因的表达与水稻对稻瘟病菌的抗性有关。上述研究结果表明LIL1基因能激活水稻产生类似HR的过敏性坏死反应，并提高水稻对稻瘟病菌的抗性。有关LIL1基因的研究结果为揭示植物抗病防卫反应提供了重要信息。