水稻类病斑基因OsSPL35的生物学功能及抗病性调控机制研究

Lesion mimic mutants with the phentypes resembling hypersensitive response are widely used to reveal the mechanisms of plant disease resistance. A lesion mimic mutant was once selected from transgenic progenies of cv. Kinmaze by transferring a empty vector. The previous studies confirmed that the lesion mimic phenotype of the mutant was caused by a T-DNA insertion which disturbed the normal founction of OsSPL35 gene. This gene encodes an unknown protein with one CUE (Couupling of Ubiquitin conjugation to Endoplasmic reticulum degradation) domain.Further studies verified that the OsSPL35 gene is a novel lesion-mimic gene, which could negatively regulate both programmed cell death (PCD)and resistance to rice blast and bacterial blight in rice. In this project, we will perform over-expression and induced expression of the OsSPL35 gene under different biotic or abiotic treatments, determine differential expression genes in the spl35 muant and wild type by using the RNA-seq technique, select interacting proteins with OsSPL35 protein by using H2Y and Co-IP techniques, investigate the functions of differentail expression geness by using transgenic techniques, and evaluate the spl35 mutant and transgenic progenies for their resistance to rice blast and bacterial blight, and so on. The objectives are to comprehensively dissect bilogical functions of the OsSPL35 gene, determine the role and position of the OsSPL35 gene in PCD, protein ubiquitination and plant defense pathways, and explore some braod-spectrum resistance genes effecive to rice diseases.

植物类病斑突变体因其表型与抗病过程中的过敏反应类似而被广泛应用于植物抗病机理研究。我们从粳稻品种Kinmaze转空载体后代中发现一个类病斑突变体，经深入研究确认其类病斑表型是由于T-DNA插入干扰了一个编码包含CUE结构域蛋白的基因OsSPL35 (暂命名）的正常功能而造成的。进一步的研究证实，OsSPL35是一个新型的水稻类病斑基因，负向调控水稻PCD和类病斑的形成、水稻防卫反应及对稻瘟病/白叶枯病的抗性。本项目拟在前期研究工作基础上，通过分子生物学（基因过表达、基因表达谱及转录谱分析等）、生理生化（类病斑发育、酵母双杂、免疫共沉淀、蛋白质质谱分析等）、分子育种（差异表达基因等的遗传转化等）及植物病理（病原菌接种、抗性机制等）的多种研究手段全面、深入解析OsSPL35基因的生物学功能，以期明确该基因在水稻PCD、蛋白泛素化和抗病信号途径中的地位及作用机制，并发掘广谱抗病的水稻基因资源。

植物过敏反应（HR）是程序化细胞死亡（PCD）的类型之一。自发产生HR类坏死斑的类病斑突变体是阐述植物PCD和防卫反应的理想试验系统。本项目以水稻类病斑突变体spotted leaf 35 (spl35)， 通过TAIL-PCR及突围克隆策略，克隆了调控类病斑表型的基因SPL35，并通过植物生理学、病理学、生物化学及分子生物学等手段研究了突变体spl35的表型及目标基因SPL35的生物学功能，取得的主要结果如下：1. 突变体spl35从3~4叶期的叶尖上开始出现红褐色斑点，是一个自发性、全生育期、受光照诱导的扩展性类病斑突变体。突变体降低了叶绿素含量，积累了大量的过氧化氢，上调了防御相关基因的表达，显著增强了对稻瘟病和白叶枯菌的抗性。2. 控制该突变体类病斑表型的基因SPL35基因编码一个包含CUE结构域蛋白，呈组成型表达，并在一定程度上受到生物和非生物胁迫的诱导，其过表达和RNAi干扰均能导致突变体表型。3. SP35蛋白主要定位在细胞质中的细胞质、内质网及未知的点状结构中，可以与单分子泛素、泛素化E2结合酶OsUBCa和两个网格蛋白Delta-COP1和Delta-COP1互作。4. OsUBC5a和两个Delta-COP基因的RNAi植株也显示出细胞死亡的表型，同时造成Spl35基因的表达上调，而在突变体spl35中三个互作蛋白基因下调表达。5. 研究结果表明，SPL35基因可能通过调控OsUBC5a和两个Delta-COP基因参与泛素化和蛋白质运输等过程，为揭示SPL35基因调控细胞死亡与防卫反应机制提供了证据。. 与此同时，本项目研究了另一水稻类病斑突变体spl33，并克隆了目标基因SPL33。与突变体spl35类似，spl33也显著上调防卫基因表达并增强对稻瘟病和白叶枯病的抗性。SPL33 基因j编码一个eEF1A-like蛋白，在水稻所有组织器官和发育时期表达，其编码的蛋白定位于细胞质的内质网。转录组分析显示，SPL33基因功能的缺失导致细胞死亡、早衰和防卫反应，活性氧（ROS）积累是导致细胞死亡和突变体表型的原因，而大量天然免疫相关基因及信号分子的激活是突变体抗病性增强的原因。研究结果证明，eEF1A-like 蛋白SPPL33参与了植物PCD和抗病信号通路。