基于CRISPR/Cas9系统高通量筛选参与MR1转运及向MAIT抗原递呈的功能基因

Major histocompatibility-related protein 1 (MR1) is an antigen presenting molecule which activates an abundant T cell subset in humans, called mucosal-associated invariant T (MAIT) cells. MR1 presents a completely novel type of antigen: small metabolites derived from the synthesis of Vitamin B by a wide range of pathogenic bacteria and yeast. After MR1 presents these antigens to MAIT, MAIT cells become activated and initiate immune responses against the invading microbes. MAIT cells are involved in a variety of autoimmune and immunomodulatory diseases, which are also found in tumor tissues. However, how do the MR1-antigen complexes traffic to the cell surface and initial MAIT immune response which is unclear. Using CRISPR-Cas9 genome-wide screening, the project identified ARF4, DHDDS and DUPD1 deficiency impaired of MR1-antigen trafficking to cell surface and MAIT activation after ligands treatment. Based on this, the biological functions of candidate genes will be validated on cellular and animal models. The proposed project will unravel a novel mode to activate the immune system and reveal new approaches to harness the immune system against infections, autoimmunity and cancer.

主要组织相容性相关蛋白1（MR1）是一类新发现的抗原递呈分子，它将微生物合成维生素B2过程中产生的代谢产物递呈给粘膜相关恒定T细胞（MAIT）从而启动免疫反应。MAIT是一类天然免疫T细胞亚群，其发育和活化依赖于MR1。MAIT被证实在细菌，真菌等引发的感染中起关键免疫保护作用。MAIT参与多种自身免疫和免疫调节类疾病，其亦被发现存在于肿瘤组织中。然而，目前对于MR1-抗原复合体如何迁移到细胞膜并向MAIT递呈抗原进而引起免疫反应的机制还不清楚。本项目利用CRISPR-Cas9全基因组筛选，发现ARF4、DHDDS、DUPD1基因的缺失抑制MR1-抗原复合物向细胞膜转运及MAIT的激活。后期将在细胞和动物模型上验证候选基因的生物学效应。该项成果有望发现一种新的免疫机制，为治疗感染、癌症等疾病的免疫疗法提供新的理论依据，同时也为寻找现有免疫疗法对部分患者失效的临床难题提供新的突破方向。

主要组织相容性相关蛋白1（MR1）是一类新近发现的抗原递呈分子，它将细菌和酵母合成维生素B2过程中所产生的代谢产物递呈给粘膜相关恒定T细胞（MAIT）从而启动相关免疫反应。MAIT是一类新型天然免疫T细胞亚群，其发育和活化依赖于MR1。MAIT细胞被证实在细菌，真菌及病毒等引发的感染中起关键免疫保护作用。MAIT细胞也参与了多种自身免疫和免疫调节类疾病，其亦被发现存在于原发性及转移性肿瘤组织中。然而，目前对于MR1-抗原复合体如何迁移到细胞膜并向MAIT递呈抗原进而引起免疫反应的机制还不清楚。. 本项目利用CRISPR-Cas9技术，进行全基因组筛选能够调控MR1转运的基因。通过筛选，我们发现ARF4、DHDDS、DUPD1基因的sgRNA被显著富集。运用细胞流式分析技术以及激光共聚焦实验发现，ARF4、DHDDS、DUPD1缺失显著抑制了MR1在细胞膜表面的的表达以及定位。进一步的，我们发现，相对于野生型细胞来说，ARF4-/-, DHDDS-/-或者DUPD1-/-细胞与MAIT细胞孵育后，对5OPRU诱导的MAIT的激活能力有明显的抑制作用，同时对5OPRU诱导的MAIT细胞的毒性也有显著的损害。这些结果证明：ARF4、DHDDS、DUPD1在MAIT配体诱导的MR1想细胞膜转运过程中发挥着关键作用，同时对MAIT细胞发挥功能也很重要。目前ARF4的基因敲除小鼠即将构建成功，后期将进一步在动物模型上验证ARF4对MAIT功能的影响以及对MR1的膜定位的影响。. 该项成果将有望发现一种全新的免疫机制，为治疗感染，自身免疫及癌症等疾病的免疫疗法提供新的理论依据，同时也为寻找现有免疫疗法（诸如PD-1疗法）对部分患者失效的临床难题提供新的突破方向。