水稻类病斑突变体SPL41基因的克隆及抗病分子机制研究

Lesion mimic mutants are characterized by the formation of necrotic lesions spontaneous in the absence of environmental stress, physical damage and pathogen attack. Lesion mimic mutants develop lesions resembling disease symptoms or hypersensitive response associated cell death. Lesion mimic mutants usually showed enhanced resistance to plant pathogen and activated the expression of plant defense related genes. Therefore, lesion mimic mutants become the important models for elucidating the molecular mechanism of disease resistance. In our lab, we isolated a rice lesion mimic mutant from the descendants of the indica cultivar “Huang hua zhan”, which was treated by EMS. The lesion mimic mutant spl41 showed enhanced resistance to PXO99 compared to WT. Through next-generation sequencing genomic DNA of F2 hybrids and compared with that of WT, we found a point mutation“G to A” at 523 bp position upstream of ATG of the annotated gene LOC_Os01g25450. The function of this gene was unknown. We confirmed that this point mutation in promoter region led to induce promoter activiey. In this project, we plan to clone the full length sequence of gene driven by this promoter using RACE technique and elucidate the function of this gene and the molecular mechanism involved in rice resistance to PXO99. Our results will greatly contribute to its future application in rice molecular breeding for bacterial blight and blast disease resistance.

植物类病斑突变体是指一类在没有逆境、损伤或病害情况下就能自发形成类似病原物入侵后产生的坏死斑状的突变体，往往具有抗病性强和防御相关基因组成型高表达等特点。因此，对类病斑突变体的研究对揭示植物抗病性机制具有重要意义。本实验室通过大规模筛选水稻EMS诱变M2代观察到一株新颖的类病斑突变体，暂命名为spl41，对水稻白叶枯病的抗性显著高于野生型。通过对突变体与野生型水稻杂交后F2代基因组进行高通量测序，确定该突变体的表型与RGAP7注释基因LOC_Os01g25450的ATG上游第523个碱基由G突变为A共分离。该注释基因功能未知，其ATG上游2000bp启动子的活性分析表明该点突变造成了启动子活性显著上升。本项目将研究：(1)确定该启动子驱动的基因全长序列；(2)阐明该基因的功能及其提高水稻抗白叶枯病菌的分子机制。以上研究结果将全面解析该基因的功能及其抗病分子机理，为水稻抗病育种提供理论依据。

水稻类病斑突变体是指一类在没有逆境、损伤或病害情况下就能自发形成类似病原物入侵后产生的坏死斑状的突变体，往往具有抗病性强和防御相关基因组成型高表达等特点。因此，对水稻类病斑突变体抗病分子机制的解析对理解水稻抗病机制及培育水稻抗病品种具有重要意义。本实验室前期通过大规模筛选水稻EMS诱变突变体，得到一株水稻类病斑突变体spl41，前期的研究结果表明，该突变体对水稻白叶枯病原菌具有很好的抗性，其定位注释基因LOC_Os01g25450ATG上游523bp处发生一个G到A的点突变，该点突变启动子序列可以驱动GUS基因的表达。本项目对spl41突变体的农艺性状及广谱抗病性进行了检测等，发现spl41类病斑突变体的农艺性状指标如株高、穗长、分蘖数、结实率、千粒重等较野生型HHZ显著降低；spl41叶片类病斑的产生依赖于光照，叶绿体出现畸变，叶片中活性氧爆发，过氧化氢，超氧阴离子，丙二醛含量上升，活性氧清除机制相关酶活指标均显著高于野生型HHZ。Spl41突变体对所检测的7种水稻黄单胞病原菌、3种水稻稻瘟病原菌、1种水稻条斑病原菌具有广谱抗病性；叶片中的防卫基因过量表达。该点突变启动子序列可以激活GUS/RUBY报告基因的表达。通过克隆该基因全长进行水稻遗传转化以及对野生型HHZ点突变单核苷酸进行定点基因编辑，发现转基因水稻和基因定点编辑水稻出现了矮化的表型，但并未产生类病斑的表型。结合5’RACE实验扩增出的序列，在CPC 2.0生物信息学网站预测，发现该位点的单碱基突变可能为一个non-coding RNA，从而调控水稻的生长发育，该新机制目前正在研究中。我们重新构建了水稻F2代分离群体，对双亲及混池进行了基因组重测序和BSA定位，筛选到了520个差异SNP位点，结合双亲及混池各位点的基因型分布和多组学分析，新得到了6个相关基因，转基因水稻遗传互补实验正在进行中。此外，还发现了RLCK118-OsOSK3-OsMYB9调控水稻对PXO99抗病性的分子通路，我们的研究结果为水稻抗病分子育种提供了一定的理论依据。