利用HITS-CLIP技术解析哺乳动物Argonaute蛋白的功能分工

Argonaute (AGO) proteins are the core effectors of small RNA-mediated gene silencing pathways. Multicellular organisms usually have multiple AGO family proteins. In lower organisms such as Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster, multiple AGOs have evolved specialized functions for distinct RNA silencing pathways. By contrast, in mammalian cells the functional division of different AGO proteins as well as the mechanisms remain to be elucidated. In the previous study we found that the expression patterns of four AGO proteins (AGO1-4) are significantly different in the livers of developing mouse embryos, providing an excellent model for the research on the functional division of mammalian AGO proteins in vivo. On this basis, we will utilize the HITS-CLIP approach (high-throughput sequencing of RNAs isolated by crosslinking immunoprecipitation) combined with bioinformatic analysis to systematically identify and compare the AGOs-associated small RNAs and their targets in mouse embryonic liver cells at transcriptome-wide level, demonstrate the dynamic changes of the gene regulatory networks composed by individual AGOs-small RNAs-target RNAs during liver development. Altogether, this study will clarify the specialized role of each AGO protein and shed light on the biological significance of the unique expression patterns of AGO proteins during liver development.

Argonaute（AGO）蛋白是小RNA介导的基因沉默途径的核心效应分子。多细胞生物通常有多个AGO蛋白。在果蝇、线虫等低等生物中，多个AGO已演变出专门的职能参与不同的RNA沉默途径。相比之下，关于哺乳动物不同AGO蛋白在细胞中如何分工及其机制如何仍有待阐明。我们前期研究发现：在胚胎发育的小鼠肝脏中，四个AGO（AGO1-4）的表达模式有很大差异，为我们解析体内AGO之间的分工提供了良好的研究模型。在此基础上，本项目拟采用HITS-CLIP技术 (紫外交联免疫沉淀获得RNA进行高通量测序)，结合生物信息分析，在转录组水平系统研究小鼠胚肝细胞中不同AGO蛋白在小RNA分拣和靶标选择上的异同，解析肝脏发育过程中不同AGO蛋白-小RNA-靶标组成的基因调控网络的动态变化，阐明四种AGO蛋白的特异性职能及其独特的表达模式对于肝脏发育的重要意义。

Argonaute（AGO）蛋白是小RNA介导的基因沉默途径的核心效应分子。在果蝇、线虫等低等生物中，多个AGO已演变出专门的职能参与不同的RNA沉默途径。相比之下，关于哺乳动物不同AGO蛋白在细胞中如何分工及其机制如何仍有待阐明。本项目中，我们原计划采用HITS-CLIP技术，在转录组水平系统研究小鼠胚肝细胞中不同AGO蛋白在小RNA分拣和靶标选择上的异同，解析肝脏发育过程中不同AGO蛋白-小RNA-靶标组成的基因调控网络的动态变化。由于其它三种AGO蛋白內源表达量过低而未能成功进行CLIP实验，我们只成功构建了AGO2蛋白的CLIP文库。尽管如此，我们获得了三个重要发育时间点（e12.5，e15.5，e18.5）胚胎肝组织的6个AGO2-CLIP文库，得到了超过10万个miRNA：target调控关系，鉴定了肝细胞中重要miRNA的很多新靶标，特别是系统解析了肝脏特异性表达miR-122的体内靶标组，对于理解microRNA在肝脏发育过程中的作用具有重要意义。.根据我们获得的CLIP数据，结合国际上miR-122最新研究进展，我们适时调整了原有研究计划，改为miR-122的靶标组与其生物学功能的研究，特别是解析miR-122缺失导致肝细胞病变的分子机理，以及HCV感染过程中miR-122的作用及分子机理。通过研究我们发现，在HCV感染过程中，miR-122虽然显著促进HCV蛋白的翻译，但同时也可以强烈刺激肝细胞天然免疫系统，促进干扰素合成，帮助肝细胞抵抗HCV侵染。通过进一步研究我们发现，miR-122通过靶向一组蛋白而抑制STAT3的磷酸化激活，从而解除了STAT3对干扰素信号通路的抑制。该发现不但揭示了miR-122在HCV感染过程中的双重作用，而且揭示了HCV抑制宿主天然免疫系统的新机制，具有重要意义。同时，由于STAT3的组成型激活是肝癌发生发展的重要标志，因此我们的发现也揭示，肝癌发生过程中miR-122缺失是导致STAT3组成型激活的重要原因之一，同时也是肝癌细胞炎症通路激活和免疫逃逸的重要机制。目前该部分结果的研究论文已经在投稿当中。