三七趋化性内生生防细菌的生物多样性研究

Root-rot disease complex (RRDC) caused by multi-pathogens is .the most damaging disease of Panax notoginseng in agriculture. It is urgent to find novel biocontrol resources for the RRDC.Objective of this project is to exploit the chemotactic endophytic bacteria with biocontrol potential against the RRDC from P.notoginseng and to characterize their biodiversity. By using the representative pathogens of RRDC as targets, we will firstly screen the antagonists from endophytic bacteria of P. notoginseng. Then, by combination of histidine kinase gene (cheA) probe and plate assays, we will screen those chemotactic strains out from the bacterial antagonists using root exudates of P. notoginseng as chemotactic substance.Thirdly, we will elucidate the species diversity and ecology diversity on the chemotactic endophytic bacterial antagonists from P. notoginseng based on the methods of BOX-PCR genomic DNA ?ngerprinting and the 16S rRNA gene sequences analysis. Fourthly, we will identify the chemical components in root exudates of P. notoginseng by GC/MS method, and determine the relationship beween single component of root exudates and chemotactic bacteria after plate assay. Additionally, we will characterize the functional diversity on these antagonists from perspectives of the connections between bacterial species and chemotactic substrats, also and the antagonistic ranges.Results of this project will promote our understanding on the biodiversity and functions of endophytes from the Panax spp., and will provide the novel bacteria applying to biocontrol of RRDC.

由多种病原复合侵染引起的三七根腐病是限制三七产业可持续发展的重要因素之一，发掘新型生防资源是该病害生物防治的迫切需要。本项目围绕拮抗三七根腐复合病原的趋化性内生生防细菌资源的发掘及其生物多样性研究主题，以根腐病复合病原中代表性病原为靶标，从三七内生细菌中筛选拮抗性菌株；结合组氨酸激酶基因(CheA)分子探针及平板趋化测定方法，从拮抗性细菌中筛选趋化三七根系分泌物的内生生防细菌；基于BOX-PCR 指纹图谱及16S rRNA基因序列分析方法阐明三七趋化性内生生防细菌的物种多样性特征及在三七不同组织中的生态多样性特征；利用GC/MS分析三七根系分泌物化学组分并通过根系分泌物单一组分化学纯品的平板趋化测定，并从"细菌种类与趋化物，细菌种类与拮抗谱"间的关系分析三七趋化性内生生防细菌的功能多样性特征。研究结果有助于认知人参属中药材内生菌生物多样性及其功能，为其复合病害的防治提供新型生防资源。

三七（Panax notoginseng）是云南的特色名贵中草药植物。由病原线虫、细菌、真菌复合侵染引起的三七根腐病是三七种植中危害最为严重的病害。从三七内生菌中发掘兼抗多种病原的新型生防资源对促进该病害的生物防治有重要意义和应用潜力。本项目围绕“拮抗三七根腐复合病原的趋化性内生生防细菌资源的发掘及其生物多样性研究”主题开展研究，获得以下主要研究结果：1.本项目从采文山州及泸西县三七种植区健康三七植株的五种组织（叶、叶柄、根、茎和种子）中共分离内生细菌2，000株，以三七根腐病复合病原中的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）和根结线虫（Meloidogyne sp.）为靶标，从中筛选出222株至少对三种供试病原中的一种具有活性的拮抗菌，占筛选总菌株数的11.1 %。在这些生防内生细菌中，129株显示单抗活性，仅对三种病原中的一种具有活性，72株显示双抗活性，对三种病原中的二种具有活性，仅有22株内生菌显示三抗活性，对供试的三种病原都有生防活性。2. 通过16S rRNA基因系统发育分析，三七内生生防细菌分别属于放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）中的14属、25个种。芽孢杆菌属（Bacillus）是三七内生生防细菌的优势属（104株拮抗菌中77.89%的为芽孢杆菌属）；B. amyloliquefaciens subsp. plantarum （27株）和B. methylotrophicus（24株）为优势种。3. 通过CheA基因检测法从222株三七内生生防细菌中筛选出56株趋化性生防菌, 系统发育分析表明这些趋化性细菌分别归属于厚壁菌门（Firmicutes）（35株）、变形菌门（Proteobacteria）(19株）和放线菌门（Actinobacteria）(2株）中的15属、30个种，芽孢杆菌属（Bacillus）是三七趋化性内生生防细菌的优势属（56株趋化性细菌中50.0 %的为芽孢杆菌属）。4. 通过GC-MS分析鉴定出三七根系分泌物62种，分别属于烷烃类、酮类、酯类、苯类、苯酚类、烯类等类型。5.利用平板检测法评估了32株代表性三七趋化性内生生防细菌对根系分泌