高粱原花青素营养补充剂对口腔致龋齿菌粘附的干预及分子机制

Dental caries have become the most important effect on oral cavity health. The precondition of dental caries occurred is that bacteria adhere on tooth face through specific binding between its adhesins and salivary acquired pellicle. Intercepting this process could prevent dental caries fundamentally. Sorghum procyanidins nutrition-supplements could interfere in the development of dental caries obviously, but its effect mechanism isn't known. According to this problem, this research the separation and identification of salivary acquired pellicle and bacteria adhesions through proteome, chromatogram and spectrum technology. The interaction mechanisms of SPC and adhesions are studied adopting fluorescence spectrum, UV, ATR, CD and DSC, the molecule mechanism of SPC preventing dental caries could be revealed. On the foundation of above, the construction of SPC which could interfere dental caries effectively are identified using MS, NMR and CD, structure-function relationship of SPC could be identified accordingly. Completion of this study will provide valuable theory evidence and science reference of the effect of SPC on oral cavity health.

龋齿已成为影响口腔健康的首要问题，其发生的先决条件是致龋齿菌通过其表面黏结素与唾液获得性膜中蛋白受体特异性结合而在牙面粘附，阻断这一过程能从根本上干预龋齿发生。高粱原花青素（SPC）营养补充剂能明显干预龋齿发生，但是其作用机制并不清楚。针对这一科学问题本项目通过蛋白质组学及多种色谱、光谱技术对主要致龋齿菌表面粘结素以及唾液获得性膜中蛋白受体进行分离、鉴定；然后采用荧光光谱、UV、ATR、CD及DSC等手段，阐明筛选出的高干预龋齿活性SPC组分与粘结素和蛋白受体的作用机理，从而揭示SPC干预致龋齿菌在唾液获得性膜上粘附的分子机制；在此基础上对干预龋齿活性高的SPC组分的结构通过降解和MS、NMR及CD等进行表征，明确SPC干预龋齿的构效关系。本项目的完成将为原花青素营养补充剂在口腔健康中的作用提供有价值的理论依据和科学参考。

龋齿是影响人类口腔健康的首要问题，其发生的先决条件是致龋齿菌（如：变链菌和远缘链球菌等）通过其表面粘结素与唾液获得性膜中蛋白受体特异性结合而在牙面定居，阻断这一过程能从根本上干预龋齿的发生。原花青素具有预防龋齿的效果，但是其作用效果与机制未被揭示。本项目的主要研究内容和结果如下：.1.分离制备得到高粱原花青素（SPC）的三个组分经RP-HPLC-ESI-MS/MS鉴定分别为B型二聚体、B型三聚体和B型四聚体。.2.三种SPC低聚体分别单独处理唾液、唾液获得性膜和变形链球菌（S. mutans Ingbritt(C) ）以及远缘链球菌（S.sobrinus ATCC 6715），发现三种SPC低聚体皆可以干预变形链球菌和远缘链球菌在体外模型模拟牙齿表面的粘附，但是处理变形链球菌以及远缘链球菌是干预两种致龋齿菌在牙面粘附的主要途径；且SPC四聚体的干预效果最优。.3.采用基因克隆和诱导表达的方式，并结合亲和层析纯化，得到变形链球菌表面粘结素中两种蛋白——葡萄糖基转移酶功能区（GTFB/CAT）、葡萄糖结合蛋白（GBPB-sumo）和远缘链球菌表面的非水溶性葡萄糖基转移酶（GTF-I）的CAT区蛋白。.4.荧光光谱分析发现SPC四聚体能分别与GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白和GTF-I/CAT产生静态淬灭，通过疏水作用力结合形成不发荧光的复合物，结合位点数皆是1；紫外光谱分析表明SPC四聚体能对GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo和GTF-I/CAT中芳香族氨基酸残基所处的微环境造成影响，并发生红移现象。同时还通过圆二色光谱分析发现GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白的二级结构均因与SPC四聚体的结合而发生改变。可见SPC四聚体使蛋白内维持结构稳定性的氢键遭到破坏，且其内部疏水区域的一些氨基酸残基可能被暴露出来，导致蛋白的二级结构发生改变，从而影响了变形链球菌和远缘链球菌在牙面获得性膜上的粘附和定植。.5.采用蛋白组学技术发现SPC低聚体与唾液获得性膜中的受体蛋白——唾液α-淀粉酶（HSA）类发生结合，荧光光谱、CD、DSC和紫外光谱研究表明SPC四聚体与HSA结合后使其构象改变进而对致龋齿菌粘附作用产生抑制，这也为干预致龋齿在牙面的粘附做出贡献。