一氧化氮在铜绿假单胞菌对异噻唑啉酮类杀菌剂抗性机制中的分子作用

Isothiazolones are a type of highly active bactericides that is frequently used in the systems of industrial anti-corruption and antiseptics. Although more and more bacteria become much more resistant to isothiazolones, it is still unclear about the certain resistance mechanisms. The results of transcriptome analyses indicated that metabolic pathway of nitric oxide (NO) played an important role in the resistance mechanism to isothiazolones in Pseudomonas aeruginosa (PA). However, it is unknown about the entirely molecular mechanisms. First of all, the effects of exogenous NO on drug tolerance, and the formation, structures and components of biofilms of PA were studied. And then, two important enzymes that employed for NO metabolism: nitrite reductase (nirS) and NO reductase (norCB) were disrupted using the method of homologous recombination. Meanwhile, the drug tolerance, and the formation, structures and components of biofilms, and relevant effectors in some signal transductions of the above two gene knockout mutants were also studied to reveal the molecular functions of endogenous NO. The results of the above researches would be compared and the molecular relationships of NO, drugs tolerance and biofilms formation and dispersal in PA would be constructed to provide technical and data supports for prevention and control of drug resistance for industrial bactericide using NO.

异噻唑啉酮类杀菌剂是一种在工业防霉防腐体系中广泛使用的高效杀菌剂，但越来越多的细菌对其产生了抗性，而其中的抗性机制至今都未完全阐明，转录组数据分析提示气体信号分子一氧化氮（NO）代谢通路在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）对异噻类药物的抗性机制中具有重要的贡献，但其中的分子机制不明。因此，本课题首先研究外源的NO对铜绿假单胞菌耐药性和生物膜形成、结构及成分的影响；然后利用基因同源重组的方法分别敲除内源NO代谢过程中两个重要酶：亚硝酸盐还原酶（nirS）和NO还原酶（norCB），并研究敲除菌株的抗药性和产生物膜等的表型变化及其相关信号通路的效应因子；最后将内外源的NO在异噻抗性机制中的作用进行对比，从而探明气体信号分子NO及其相关响应因子或信号通路在铜绿假单胞菌抗药性和生物膜形成及降解中的分子作用，为利用NO防治工业杀菌剂抗药性的产生提供理论依据和数据支撑。

异噻唑啉酮类杀菌剂是一种在工业防霉防腐体系中广泛使用的高效环保型杀菌剂，转录组数据分析提示气体信号分子一氧化氮（NO）代谢通路在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）参与了对该类杀菌剂的抗性，但其中的分子机制不明。因此，本项目选取NO代谢通路里的三个重要酶：硝酸盐还原酶（Nitrite reductase，nirS）和NO还原酶（NO reductase，norCB和norD），对它们进行了基因敲除和回补，研究它们敲除以后对异噻唑啉酮类杀菌剂的典型代表BIT的抗性变化，以及本身形成生物膜能力的改变和菌体转录组的变化以及其它相关表型的变化，从而揭示铜绿假单胞菌对BIT产生抗性的部分分子机制。nirS基因是铜绿假单胞菌菌体生长的负调控因子，对生物膜的形成和BIT的抗性具有重要的贡献，且这种贡献是通过调节胞内的第二信使c-di-GMP的表达量和外排蛋白mexEF-oprN的表达量来实现；转录组测序结果表明，与WT相比，在ΔnirS中共有694个差异表达的基因（DEGs），其中192个基因被激活而502个基因被抑制，所有DEGs被显著富集在：碳代谢以及乙醛酸和二羧酸代谢通路。与此同时，norCB基因敲除以后，ΔnorCB浮游菌的生长未受到显著的影响，但生物膜的形成量稍有降低；随着BIT浓度的增加，ΔnorCB浮游菌和生物膜分别受到抑制，并具有浓度依赖性，但是ΔnorCB具有比WT更高的对BIT的抗性；norCB基因影响了铜绿假单胞菌的泳动，并呈浓度依赖；norCB的敲除影响了绿脓菌素的合成；norCB的敲除导致菌体对H2O2的抗性降低和胞内过氧化氢酶含量的下降；对于ΔnorCB来说，norD，hpd和rpoN显著上调，说明norCB基因的敲除会对其它基因的表达产生影响。最后发现norD的缺失，导致铜绿假单胞菌浮游菌和生物膜对BIT的抗性增强；并且延长了菌体进入生长曲线平台期的时间；norD基因影响了铜绿假单胞菌的泳动；但未影响绿脓菌素的合成，但由于norCB的缺失，BIT对菌体合成绿脓菌素抑制作用减弱。上述研究结果提高了我们对铜绿假单胞菌对异噻唑酮类抗性机制的理解，并为避免此类药物产生抗药性提供理论基础，并揭示了好氧条件下，胞内的气体信号分子相关基因的功能和表达调控机制。