魏氏柠檬酸杆菌外膜蛋白在钙离子促进生物被膜形成中的作用及其机制

Outer membrane proteins play key roles in bacterial life processes, such as growth and metabolism, biofilm formation and regulation, and enviromental adaptation. In previous studies, we found that high concentrations of exogenous calcium ions promoted significantly the formation of Citrobacter werkmanii biofilms, and this process was partly mediated by three outer membranne proteins (OmpA, OmpF and OmpX), which was verified by two-dimensional electrophoresis and gene knock-out, but the specific regulatory mechanism was unknown. Therefore, the subject focuses on the functional characterizations and regulatory network of ompA, ompF and ompX in mediating the biofilm formation under normal conditions and the stress of calcium ions. Mutants including single-gene disruption, double-gene disruption, complement and over-expressed strains are obtained to analyze the differences of growth and development, biofilm formation, and structural components and mechanical parameters of biofilms under normal conditions and the stress of calcium ions. Moreover, changes in the transcriptional expression of total genes in planktonic and biofilm cells are detected by transcriptome sequencing to analyze the possible regulatory pathways of three outer membranne proteins participating in the response to calcium ions and biofilm formation. Finally, qRT-PCR and the disruption of key genes are used to verify the regulatory pathways. The above results will clarify the regulatory network and the correlation of three outer membrane proteins in mediating biofilm formation and calcium sensing of C. werkmanii, which may be helpful for further studies on environmental adaption and the application and control of biofilms of C. werkmanii, and on the correlation between environmental factors and biofilm formation.

外膜蛋白在细菌代谢、生物被膜形成与调控、感应外界刺激等生命过程中具有重要的作用。本人前期研究发现：较高浓度的外源钙离子促进魏氏柠檬酸杆菌生物被膜的形成，且双向电泳及基因敲除初步结果表明外膜蛋白OmpA、OmpF和OmpX参与此过程，但其调控机制不明确。因此，本项目拟对OmpA、OmpF和OmpX进行单/双基因敲除、回补和过表达，比较各工程菌株在正常条件及钙离子胁迫条件下的生长发育、生物被膜的形成和结构与原始菌的差异，明确三个外膜蛋白各自功能及相互间关系；再者利用转录组测序检测在正常条件和钙离子胁迫条件下各工程菌株的浮游菌及生物被膜细胞中基因表达变化，并进一步验证核心基因突变后表型变化，从而明确三个外膜蛋白调控魏氏柠檬酸杆菌响应外源钙离子胁迫及其生物被膜形成的分子网络。该研究将为魏氏柠檬酸杆菌环境适应性及其生物被膜的防控和利用提供分子基础，为研究外源刺激与生物被膜形成的相互关系提供理论依据。

细菌外膜蛋白（Omps）在维持细胞外膜结构、调控细胞代谢、保护细胞免受外界有害物质或者极端环境影响等过程中起着重要作用。本团队前期研究发现Ca2+胁迫条件下的魏氏柠檬酸杆菌（Citrobacter werkmanii）中的三个外膜蛋白（OmpA、OmpF和OmpX）具有不同的表达水平，但这三个外膜蛋白在钙离子响应和其它环境适应性等方面的功能和机制未知。鉴于此，本项目利用基因敲除和超表达以及转录组测序等技术手段，深入解析了魏氏柠檬酸杆菌中三个外膜蛋白的分子功能。结果发现：敲除ompA会导致菌株在聚苯乙烯和玻璃表面上的生物膜形成增加、细胞聚集增加、菌落更平滑、生物膜的泳动能力和对BIT抗性增加，共发现1,470个差异表达的基因（DEGs），其中146个基因上调，1,324个基因下调，并且DEGs显著富集到芳香族化合物、鞭毛组装和磷酸盐和次磷酸盐代谢的降解等通路；而ompF参与聚苯乙烯和玻璃表面上的生物膜形成、细胞聚集、菌体泳动、渗透反应以及不同基因表达水平的调节，1,791个基因差异调节，其中989个基因被激活，802个基因被抑制，差异基因主要富集于丁酸代谢、细菌分泌系统和蛋白质输出等通路，此外，malEFGK2基因簇有助于该菌株麦芽糖的运输，并首次发现malT可以通过结合OmpF上游启动子的方式来调节该蛋白的表达；OmpX在各种生物过程中发挥着至关重要的作用，包括菌体聚集、生物膜形成、泳动能力、金属离子胁迫响应、杀菌剂抗性、碳源代谢、不同环境中的微生物代谢等，另外1,357个基因受到差异调节，其中465个基因被激活，892个基因被抑制，DEGs被显著富集到碳代谢和不同环境中的微生物代谢这两个代谢通路，同时，ompX的基因表达可能受到tdcA和rbsR的调控。另外，在低浓度钙离子胁迫条件下菌体生物膜形成量的增加，其OmpA和OmpF是其靶位点，而OmpX不是，但是在高浓度钙离子存在时，更多的是通过减少菌体表面电荷等物理作用增加生物膜的形成，外膜蛋白起到的作用有限。本研究结果可为魏氏柠檬酸杆菌环境适应性及其生物被膜的防控和利用提供分子基础，为完善外膜蛋白作用机制网络提供有力素材，并为研究外源刺激与生物被膜形成的相互关系提供理论依据。