谷胱甘肽对铜绿假单胞菌致病性的作用机理研究

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是细胞内最重要的抗氧化剂，在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染组织中水平异常低。能否利用GSH治疗P.aeruginosa感染性疾病，研究结果并不一致。我们研究结果显示,GSH在P.aeruginosa细胞内水平的变化，可以调节毒性因子的表达、改变细菌的耐药性，与P.aeruginosa的致病性密切相关，但具体机理尚不清楚。本项目以P.aeruginosa启动子库为平台，在全基因组水平筛选受GSH影响的基因，通过研究这些基因的功能，分析基因表达的调控网络，揭示GSH对P.aeruginosa致病性的作用机理及其在细胞中的具体功能。同时通过建立果蝇感染模型，在机体水平验证GSH和P.aeruginosa致病性的关系，寻找GSH控制P.aeruginosa致病性的关键靶位点，为解决P.aeruginosa感染提供新途径。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），作为一种院内致病菌，对宿主细胞引起的氧化伤害是其导致病人感染死亡的原因之一。谷胱甘肽（glutathione，GSH）、N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cystine，NAC），作为细胞内最重要的抗氧化剂，在机体抗氧化剂防御系统中起重要作用。构建谷胱甘肽合成酶基因（Glutathione synthetase，gshB）突变株PAO1(ΔgshB)，我们研究发现，PAO1(ΔgshB) 绿脓菌素（pyocyanine，PCN）生成量降低，外加GSH则可促进P. aeruginosa中与PCN生成相关的毒力相关基因phzA1、gacA的表达。于P. aeruginosa耐药性而言，外加GSH 或NAC可降低P. aeruginosa对抗生素庆大霉素（Gen）、红霉素（Em）、卡那霉素（Kan）和硫酸链霉素（Strep）的敏感性，增加对氯霉素（Cm）、氨苄青霉素（Amp）、四环素（Tet）的敏感性；在低氧条件下，NAC分别使Cm、Amp、Tet和Pol的MIC降低5、2、8和4倍。此外，NAC也可降低P. aeruginosa毒力因子PCN产量以及生物膜（Biofilm，BF）的量。相对PAO1而言，PAO1(ΔgshB) Swimming和Swarming 运动能力明显降低。鞭毛和Ⅳ菌毛作为介导P. aeruginosa运动的两大毒力因子，在P. aeruginosa粘附和毒性方面也起一定作用。通过体外构建A549细胞感染模型研究发现，与PAO1比较，PAO1(ΔgshB)对细胞毒性及感染能力下调。外加GSH可促进P. aeruginosa对A549细胞的粘附能力，降低P. aeruginosa对细胞的内化能力。同时，通过对A549细胞相关指标如LDH、ROS的测定得出，与PAO1比较，PAO1(ΔgshB)对细胞的毒性减弱。通过果蝇感染实验，我们进一步得出PAO1(ΔgshB)由于gshB基因的缺失，导致其毒性和感染能力降低，充分证实GSH在保护细胞免遭P. aeruginosa毒害中的重要作用。