HSP70在小鼠卵母细胞减数分裂成熟和早期胚胎发育中的作用

During the oocytes meiotic maturation and early embryo development, a large number of proteins, protein kinase and protein phosphatase or factors accurately regulate the biological events. Among them, there is a kind of protein family, which named Heat shock protein family has not been adequately studied its function and related signal pathway in the process of oocytes maturation and early embryo development. Especially the member of HSP family, HSP70, previously study showed that HSP70 might be involved in the process of sperm-egg binding and embryo development. But the specific mechanism is not clarified. At the meanwhile, HSP70 related upstream and downstream signal pathway regulating oocytes maturation and early embryo development still was a mystery. Our research attempt to employ the cellular and molecular biology methods such as immunofluorescence, immunoprecipitation, siRNA interference, Morpholino knockdown, mRNA rescue and inhibitor treatment to explore the HSP70 function in the process of meiosis, chromosome segregation dynamic, aiming at provide further thought in the area of cell cycle.

在卵母细胞减数分裂成熟和早期胚胎发育过程中存在大量的蛋白、蛋白激酶和蛋白磷酸酶等因子精准的调控着这一系列的细胞生物学事件。其中，有一类蛋白家族，即热休克蛋白家族，在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中的作用及其相关通路还未得到充分的研究。尤其是家组成员中的Heat shock protein 70（HSP70）,已有的相关研究表明HSP70可能参与精卵结合和早期胚胎发育的过程，但是具体机制还并不清楚，于此同时对于HSP70在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中参与的信号通路及上下游信号调节的机理还有待于我们去探索。本课题旨在利用免疫荧光染色、免疫沉淀、siRNA干扰、Morpholino干扰、mRNA rescue和抑制剂处理等多种细胞学和分子生物学的方法来探讨HSP70的定位、发挥作用的机制以及相关的信号通路，旨在阐明它在减数分裂过程中的作用，揭示染色体分离规律,为细胞周期的研究提供思路。

卵母细胞作为雌性生殖细胞，具有别种细胞无法代替的功能。卵母细胞的正常成熟是胚胎正常发育以及最终产生健康后代的基础。在卵母细胞减数分裂成熟和早期胚胎发育过程中存在大量的蛋白、蛋白激酶和蛋白磷酸酶等因子精准的调控着这一系列的细胞生物学事件。热休克蛋白70（Hot shock protein 70，HSP70）与卵母细胞减数分离和早期胚胎发育有关，但是相关报道却很少。本课题拟利用免疫荧光染色、免疫沉淀、siRNA干扰、Morpholino干扰、mRNA rescue和抑制剂处理等多种细胞学和分子生物学的方法来探讨HSP70的定位、发挥作用的机制以及相关的信号通路，旨在阐明它在减数分裂过程中的作用，揭示染色体分离规律,为细胞周期的研究提供思路。本研究利用免疫荧光法、激光共聚焦和免疫印记（Western blot, WB）技术检测小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中各个时期（GV、MI、MII时期）的蛋白水平的表达丰都的变化，结合免疫荧光激光共聚焦观察到的亚细胞定位情况来分析HSP70的在减数分裂过程中发挥的功能。在上述结果的基础上，采用特异性和稳定性更强的吗啉基寡核苷酸（Mopholino, MO）敲减方法，在GV期卵母细胞中运用显微注射的方法将特异性MO注射至卵母细胞中从而敲减HSP70，抑制mRNA的翻译。通过western bloting的方法检测敲减效率，统计卵母细胞成熟率。更进一步，为了验证HSP70在早期胚胎发育过程中的作用，使用特异性MO显微注射至合子期小鼠胚胎敲减HSP70，追踪统计各个时期的胚胎发育情况。在确证敲减HSP70的情况下，导致小鼠卵母细胞成熟及胚胎发育异常。进一步对其可能发挥功能的机理进行了探讨。在此基础上，通过体外激活剂补充HSP70的表达，发现在一定程度能够挽救卵母细胞的成熟失败以及早期胚胎发育异常。在获得以上结果的基础上进一步研究HSP70参与的相关信通路，首次发现HSP70在mTOR-eIF4F信号通路的中发挥作用。另外，研究发现HSP70通过调节卵母细胞转录因子Nobox进而影响卵母细胞的成熟。由于HSP70为热激相关蛋白，研究内容中添加了对卵母细胞进行热激处理，结果表明热激后导致HSP70蛋白表达量有所上调。褪黑素是一种有效的抗氧化剂，添加褪黑素导致HSP70蛋白表达量与对照组和HS组相比显著提高，推测褪黑素能够改善卵母细胞的质量。