RanBP1在卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育中的作用

In mammals, precise regulation of gametes maturation and early embryo development plays a key role in healthy growth of their progenies. Spindle is a dynamically changing subcellular structure existing during meiosis and mitosis and exerts its role on cell division. Our preliminary results showed that Ran-binding protein 1 (RanBP1) colocalized with spindle during oocyte maturation. RanBP1, a major effector of Ran-GTP, is highly conserved from yeast to human. RanBP1 plays critical roles in multiple cellular processes including nucleocytoplasmic transport, centrosome cohesion, microtubule polymerization, mitotic spindle assembly and cell apoptosis. But the role of RanBP1 on oocyte maturation and embryo development has never been reported. In this grant, we propose to study the function of RanBP1 in spindle formation and chromosome separation by immunochemistry, gene knock-down, biological mass spectrometry and other molecular biotechnology.

哺乳动物后代的健康成长依赖于配子发生和早期胚胎发育过程的精确调控。纺锤体是有丝分裂和减数分裂过程中不可或缺的动态变化的亚细胞器结构，在细胞分裂中发挥关键作用。我们之前的研究结果表明，卵母细胞减数分裂过程中，与纺锤体共定位的蛋白中有一种被称为Ran-binding protein 1（RanBP1）的蛋白。RanBP1是Ran-GTP循环中的关键调节因子，从酵母到人类高度保守。RanBPl在细胞核质运输、中心体的装配、微管的聚合、纺锤体的组装以及细胞凋亡中都发挥着重要的作用。但是RanBP1在卵母细胞减数分裂以及早期胚胎有丝分裂过程中的作用尚无文献报道。本项目旨在利用免疫组化、基因敲减以及生物质谱等技术研究RanBP1在卵母细胞成熟、早期胚胎发育过程中的表达定位以及所起的作用，了解RanBP1在卵母细胞减数分裂成熟和早期胚胎发育过程中对纺锤体组装和染色体分离所起的作用。

Ran结合蛋白1（RanBP1）是RanGTPase中的关键调控因子，在细胞核质运输、中心体的装配、微管的聚合、纺锤体的组装以及细胞凋亡中都发挥着重要的作用。本项目旨在利用免疫组化、基因敲减以及生物质谱等技术研究RanBP1在卵母细胞成熟、早期胚胎发育过程中的表达定位以及所起的作用。研究结果表明RanBP1在卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育过程中的各个时期都有表达，弥散在整个细胞质中，细胞核中的浓度较低，在纺锤体微管有明显的浓集，染色体位置浓度低。GV期卵母细胞注入特异性MO敲减RanBP1或者注入mRNA过表达RanBP1，都会使GVBD率降低约10%（89% vs 78%，91% vs 76%），第一极体排出率降低约5%（92% vs 88%，88% vs 80%），但是所有的纺锤体形态异常，染色体杂乱无章。我们构建了RanBP1、Ran、RCC1、RanGAP1和CRM1体外表达载体，脂质体转染293T细胞后，通过WB和q-PCR实验证实相应蛋白过表达成功。免疫荧光实验结果显示RanBP1、RanGAP和CRM1主要分布定位在细胞质中，Ran和RCC1除了分布在细胞质中细胞核中也具有明显的分布。RanBP1、Ran、 RCC1和RanGAP1过表达后阻碍细胞的正常分裂，染色体凝聚，出现大量多核细胞，引起细胞凋亡。WB实验结果显示RanBP1的过表达对Ran、RCC1、RanGAP1的表达量没有影响，使CRM1的表达量轻微增加。Ran、RCC1、RanGAP1和CRM1的过表达不影响RanBP1的表达量。293T细胞过表达RanBP1后同步进行TMT标记定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学研究RanBP1的调控机制。生物信息学分析发现全蛋白质组差异蛋白参与的生物过程主要包括细胞凋亡、细胞分裂G2/M转化、转录过程以及蛋白激酶结合等；激酶的变化很可能造成蛋白质磷酸化修饰的差异。磷酸化差异蛋白质进行KEGG富集的信号通路主要是是剪接体和mRNA转录。通过Pulldown和coIP实验结合质谱技术鉴定到的RanBP1相互作用蛋白参与的主要信号通路是剪接和核糖体。通过WB、Q-PCR以及转录组学实验进一步证实RanBP1参与调控剪接体进行pre-mRNA的剪接和mRNA的转录。