KIF1B在卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育中的作用

In mammals, embryo development depends on correct oocyte maturation,fertilization and acuurate cell division before implantation. Oocyte meiotic maturation and early embryo mitotic division plays key role in this process. Spindle is a subcellular structure existing during meiosis and mitosis.Organization of spindle affects the chromosome separation, thus exerts its role on gametes maturation and early embryo development. Our preliminary results showed that kinesin family member 1B (KIF1B) colocalized with spindle during oocyte maturation. As a kinesin family member, KIF1B plays key role in cellular substance transportation. But the role of KIF1B on spindle formation during meiosis and mitosis has never been reported. In this grant, we propose to study the function of KIF1B in spindle formation and chromosome separation by employing immunochemistry, live cell imaging, RNA interference as well other molecular biotechnology.

哺乳动物胚胎发育的顺利进行依赖于卵母细胞正常成熟、受精和着床前胚胎分裂的精准调控。在此过程中卵母细胞减数分裂和着床前胚胎有丝分裂能否正确进行起到至关重要的作用。纺锤体是细胞进行减数分裂和有丝分裂过程中动态变化的亚细胞结构，纺锤体能否正确组装直接影响到染色体能否正确分离，从而对成熟配子的形成与早期胚胎的细胞分裂发挥重要作用。我们的初步研究结果表明，在卵母细胞纺锤体形成过程中，有一种被称为kinesin family member 1B (KIF1B)的蛋白与纺锤体有共定位的现象。KIF1B作为驱动蛋白家族的一员，主要行使胞内物质运输分子马达的功能。关于这一蛋白在减数分裂和有丝分裂纺锤体中的作用尚无文献报道。本项目旨在利用免疫组化、活细胞成像、RNA干扰和其他分子生物学技术对KIF1B在卵母细胞成熟、早期胚胎发育过程中表达及功能进行研究，了解KIF1B在纺锤体形成与染色体分离中的作用。

卵子在减数分裂成熟过程中，染色体倍数减半是保证后代正常发育的关键因素。驱动蛋白是一类分子马达蛋白，它能利用ATP水解所释放的能量驱动自身及所携带的货物分子沿微管运动。驱动蛋白家族成员1B（kinesin family member 1B, KIF1B）是重要的微管依赖性顺式分子马达，但对于它在卵子中作用尚未报道。. 本研究以小鼠卵子为对象，研究如下内容并获得结果：.1. 检测KIF1B在卵子减数分裂成熟及早期胚胎发育过程中9个时期蛋白表达水平及亚细胞定位。发现KIF1B蛋白水平呈现间期低、中期高的表达趋势；亚细胞定位显示出随细胞周期变化的动态定位模式。.2. 使用纺锤体干扰药物处理MII期卵子以进一步阐述KIF1B与微管的关系。结果显示taxol处理后，大部分KIF1B与异常纺锤体共定位，其余则碎片化并弥散分布于胞质；nocodazole处理后，微管完全解聚，KIF1B弥散分布于胞质中。.3. 在GV期卵子中，使用特异性MO敲减KIF1B。结果显示GVBD率不受影响；但成熟过程中PB1排放率显著降低；SCCs形态异常；异倍率显著增加。.4. 在原核期合子中，使用特异性MO对KIF1B进行敲减。结果显示Kif1b MO注射组胚胎发育率显著下降；桑椹胚细胞数明显减少，细胞核形态异常；无法发育至囊胚。.5. 在2-cell期胚胎中，对两个卵裂球分别注射Ctrl MO+Ctrl MO，Ctrl MO+Kif1b MO和Kif1b MO+Kif1b MO，结果发现随着KIF1B敲减程度的加剧，胚胎发育率、桑椹胚期细胞数、细胞核形态、囊胚发育质量都显著下降。.6. 在GV及MII期卵子中，使用KIF1B特异性抗体在蛋白水平对KIF1B进行抑制。结果显示KIF1B抗体注射组GVBD率不受影响；PB1排放率显著下降；MI及MII期卵子纺锤体发生异常形变，异倍率显著增加；受精后胚胎发育率显著下降。.7. 在GV期卵子中，使用Kif1b MO对KIF1B进行敲减。结果发现Kif1b MO注射组MI和MII期卵子中期板周围线粒体不再聚集，胞质中线粒体分布异常，ATP水平下降。.以上结果表明KIF1B在小鼠卵子减数分裂成熟及早期胚胎发育过程中起重要作用。基于以上研究，可以进一步对卵子减数分裂成熟及早期胚胎发育的调控机制进行补充阐述，为人类不孕不育症的治疗和辅助生殖技术的改进提供更多理论。