比较负载高危型HPV-16E6和低危型HPV-11E6的树突状细胞抗原递呈功能的研究

It has become an emerging field of cervical cancer theraphy that dentritic cell loaded with neoplasm antigen can induce specific cellular immunity to kill cancer cells. It has reported the oncogene HPV-16E7 and HPV-16E6E7 both can pulse DC to induce CTL associated cancer killing. Although the oncogene HPV-16E6 can induce CTL, the exact capacity of CTL to kill cancer cells has not been determined yet. More importantly, it is not known whether the DC transfected with low risk HPV-11E6 can pulse CTL to kill cancer. In our previous study, we have verified the different location of high risk HPV-16E6 and low risk HPV-11E6 in 293T and MCF-7 cells. The high risk HPV-16E6 was mainly located in nulear,whearas the low risk HPV-11E6 was mainly located in cytoplasm in 293T and MCF-7 cells. It has reported that subcellular antigen location influenced CD8+CTL activation .The purpose of the present project is to check the location of high risk HPV-16E6 and low risk HPV-11E6 in DC and compare the CTL effect induced by them.Furthermore,we plan to insert nuclear location signal(NLS) of high risk HPV-16E6 to low risk HPV-11E6 sequence which named NLS-HPV-11E6.To further compare the antigen presenting function of DC and CTL effect induced by NLS-HPV-11E6 with those induced by HPV-11E6. Maybe the nuclear located NLS-HPV-11E6 can enhance the function of DC for antigen presentation.This may bring a new direction for HPV vaccine treatment..

负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)诱导抗原特异性的细胞免疫,进行肿瘤杀伤, 成为宫颈癌免疫治疗新的方向。HPV-16E6癌基因转染DC后，虽诱导产生细胞毒T细胞(CTL)的方法已成熟，但其肿瘤杀伤能力尚不清楚。更值得关注的是低危型HPV-11E6转染DC后，是否也会产生CTL进行肿瘤杀伤，未见报道。我们前期工作证实，高危型HPV-16E6和低危型HPV-11E6在细胞的定位及作用不同。因此，本课题拟通过向DC内分别转染高危型HPV-16E6和低危型HPV-11E6，比较它们在DC的定位及对DC抗原递呈和效应CTL的肿瘤杀伤能力，进一步将高危型HPV-16E6核定位信号NLS插入低危型HPV-11E6，使之入核，如果入核的低危型HPV-11E6能增加对DC抗原递呈和效应CTL的肿瘤杀伤能力，以低危型HPV-11E6作为候选抗原来抗肿瘤，将大大增加疫苗的安全性，为治疗性HPV疫苗的研究提供思路。

目前，运用树突状细胞为载体，来进行抗肿瘤免疫治疗是研究的热点。本研究拟分别采用高危型HPV-16E6和低危型HPV-11E6癌基因体外转染树突状细胞，观察他们在细胞内的定位和对树突状细胞功能的影响。拟深入研究低危型HPV-11E6转染的树突细胞抗肿瘤的能力，为研制安全高效的治疗性HPV疫苗提供依据。.在课题的研究实际进展中，初期体外培养的树突细胞转染HPV-E6的癌基因后，我们观察到高危型HPV-16E6蛋白主要定位于细胞核内，而低危型的HPV-11E6蛋白主要位于细胞浆。这与我们原有的E6转染其他细胞株的实验数据相一致。提示，高危型HPV-E6主要通过在细胞核的蛋白作用诱发癌变。而低危型HPV-E6主要位于细胞浆，可能诱发细胞凋亡而不会产生癌变，这是高危型HPV致癌和低危型HPV只引起良性增生的重要差别之一。.实验的中后期，我们与世界已成功开发HPV预防性疫苗的澳洲昆士兰大学肿瘤研究中心的Ian教授合作，取得对方HPV转基因小鼠的操作授权，大大提高了项目中的体内动物实验数据的权威性。在双方合作研究中惊喜发现，在转基因动物的实验中，HPV-16的另外一个癌基因E7比原计划的HPV-16E6癌基因更具有重要意义。于是及时调整实验方案，转向对HPV-16E7癌基因在转基因鼠中进行深入研究。实验进行转基因鼠K14E7的耳朵皮肤、脾脏、淋巴结进行单个细胞的分离，采用免疫荧光染色，流式细胞仪检测等手段，发现两种不同亚型的树突状细胞，分别为CD8+和CD103+的树突细胞，这两种亚型的树突细胞在K14E7转基因鼠比野生小鼠的数目大大增加，并且CD103+亚型的树突细胞的增加与癌症细胞的凋亡密切相关。进一步采用蛋白电泳发现在转基因鼠K14E7中，凋亡相关蛋白如Bcl-2,Bak等表达明显上升。因此，我们得到重要提示，与凋亡相关的CD103+亚型的树突细胞积极的参与了HPV-16E7的致癌机制，它可以作为未来树突细胞作为抗肿瘤疫苗的载体。我们正在后期整理数据，准备将文章投稿于SCI杂志。另外，我们还从侧面进行了的免疫相关因子IFN-r和IL-17的检测发现，在IFN-r敲除的转基因鼠K14E7中，IL-17的分泌明显上升。已知IL-17在炎症反应中表达增加，可以发挥抗炎作用，而在恶性肿瘤中，IL-17上升也预示肿瘤的加重。说明，IFN-r在宫颈癌的使用中需要高度谨慎，它一方面可