DNA甲基化在罗非鱼性腺细胞重编程中的表观遗传作用研究

我们成功诱导3月龄雌罗非鱼性逆转，卵巢细胞去分化并再分化为精巢，DNA甲基化修饰在这一细胞重编程中起重要作用。本项目拟利用AIMS法检测处理组和对照组全基因组甲基化的差异，并筛选启动子甲基化差异的性别决定相关基因，亚硫酸氢盐测序确定启动子甲基化的位点，通过以下研究揭示性逆转过程中DNA甲基化对性别决定与分化的表观修饰作用：1)荧光素酶报告基因系统离体研究有关基因启动子甲基化与否及其不同的甲基化位点对基因表达的影响，并结合在体的基因表达分析加以印证；2)通过原位杂交和Real-time PCR研究DNA甲基转移酶家族的时空表达，分析其与性别决定关键基因表达的相关关系；3)逆转中的性腺细胞经Dnmt抑制剂处理，处理组和对照组相关基因的表达和甲基化状态是否发生相反的变化，进一步证实DNA甲基化对基因表达的调控作用。本项目有助于阐明鱼类性别决定与分化的分子机制，为最终实现鱼类的性别控制奠定基础。

人工诱导3月龄雌性罗非鱼卵巢性逆转为功能性精巢，基于这一独特的实验模型，研究了DNA甲基化修饰在性逆转过程中的作用，取得如下成果：（1）通过全基因甲基化测序开展性逆转性腺和对照性腺的基因组甲基化差异研究，分别获得28.31Gb和27.31Gb的Clean碱基数，覆盖罗非鱼基因组深度达30X，初步筛选到大量甲基化差异区域，为全面解析DNA甲基化修饰在卵巢向精巢性逆转中的作用奠定基础。（2）亚硫酸氢盐测序法证实雌性通路关键基因cyp19a1a、cyp19a1b的启动子甲基化水平在性逆转中升高，而雄性通路关键基因dmrt1的启动子甲基化水平降低，与其在性逆转中的表达下调和上调呈正相关，但foxl2和cyp11b2的甲基化水平变化不明显。（3）荧光素酶报告基因实验也表明启动子完全甲基化明显抑制基因的表达，进一步证实了亚硫酸氢盐测序的结果。（4）证实罗非鱼有7个DNA甲基转移酶（Dnmt）家族成员，维持甲基化酶dnmt1在性腺发育有重要作用，而在性逆转中从头甲基化酶dnmt3、dnmt4和dnmt8可能发挥更重要的作用。（5）通过Dnmt抑制剂处理原代培养的正常雌雄性腺和性逆转性腺细胞，Dnmt的表达下调，而cyp19a1a、dmrt1的表达上调。本项目的研究结果表明，DNA甲基化在罗非鱼已分化卵巢转分化为精巢的过程中发挥重要作用。