人工诱导已分化卵巢逆转为精巢的表观遗传组学研究

Epigenetic modifications are involved in the regulation of biological processes of organisms in all aspects, and are the hot topics of the recent research. In our previous studies, the differentiated ovary of the 3-month-old female tilapia was induced to functional testis by long-term treatment with aromatase inhibitor. During the secondary sex reversal, the ovarian cells experienced a large-scale reprogramming. In the present project, based on the unique secondary sex reversal model, the change of epigenetic modifications including DNA methylome, histone modification and miRNA transcriptome will be investigated by the next generation sequencing, which include Bisulfite-seq, CHIP-seq, miRNA transcriptome sequencing. Combined with RNA transcriptome, the molecular mechanisms of sex reversal will be elucidated from the epigenetic perspective, which will be further verified by bisulfite sequencing of genes, qPCR and gene knockout. This project will provide an insight into the molecular mechanisms of sex determination and differentiation and sex reversal in teleosts from the epigenetic modifications of view. Moreover, this study is helpful for the improvement of the aquaculture efficiency through sex controlled breeding.

表观遗传修饰参与生物体各项生命活动的调控，是近年来研究的热点领域。我们前期利用雌激素合成酶抑制剂的长期诱导，使3月龄已分化的雌性尼罗罗非鱼卵巢性逆转为功能性精巢，性腺细胞经历了大规模的重编程过程。本研究基于这一独特的已分化卵巢次发性逆转模型，利用新一代高通量测序技术（Bisulfite-seq、CHIP-seq和miRNA转录组测序）和生物信息学分析，深入研究性逆转过程中DNA甲基化组、组蛋白修饰和miRNA转录组在性腺表型重编程中的变化，结合转录组关联性分析，从表观遗传组学的水平全面解析性逆转的分子机制，并通过亚硫酸氢盐测序、qPCR以及基因敲除技术进一步验证。为阐明鱼类的性别决定与分化和性逆转的分子机制以及表观遗传在其中发挥的重要作用奠定基础。同时，对罗非鱼性别决定与分化的表观遗传机制的研究，对于实现鱼类性别控制、提高水产养殖效率有重要意义。

本研究以3月龄已分化的雌性尼罗罗非鱼次发性逆转模型为基础，通过Bisulfite-seq、CHIP-seq和miRNA、转录组测序和生物信息学分析，研究了性腺细胞重编程过程中的DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA调控表观遗传修饰在其中发挥的作用，并通过亚硫酸氢盐测序、qPCR以及基因敲除技术进一步验证。取得以下主要结果：1）通过正常雌雄鱼卵巢和精巢以及次发性逆转性腺DNA甲基化组分析，阐明了正常精巢与卵巢的全基因组甲基化模式明显不同，性逆转后性腺的DNA甲基化组发生重编程，类似于精巢。2）通过转录组分析，证实性逆转后性腺的整体表达模式也类似于精巢。3）通过启动子甲基化水平和基因表达关联性分析，筛选到大量在性逆转过程中可能受到DNA甲基化调控的雌雄通路关键基因，它们的DNA甲基化水平与基因表达负相关。4）通过miRNA测序分析证实了性逆转性腺的miRNA表达模式也发生重编程，筛选到684个雄性上调和590个雌性上调的miRNA，差异表达miRNA调控的靶基因分析表明类固醇合成通路基因普遍受到miRNA调控。5）通过DNA甲基化和miRNA调控关联分析，标定了雌雄信号通路中受到调控的关键基因。6）通过CHIP-seq测序分析了组蛋白修饰对雌雄通路关键基因表达的影响，雄性特异基因dmrt1、amh、amhr2等、雌性特异基因figla、42Sp50等都受到组蛋白修饰调控。7）研究了DNA甲基转移酶家族（Dnmt）在性腺的表达定位和次发性逆转中的表达模式，证实抑制剂处理能够诱导雌鱼性逆转，表明Dnmt在次发性逆转中发挥重要作用。8）通过基因敲除和药物处理验证了一些雌雄关键基因cyp19a1a、dmrt1、esr等在性逆转中发挥重要作用。本研究结果为阐明鱼类的性别决定与分化和性逆转的分子机制以及表观遗传在其中发挥的重要作用奠定基础。同时对于实现鱼类性别控制、提高水产养殖效率有重要意义。已发表相关SCI论文9篇，作会议报告1次。获得重庆市自然科学三等奖1项，培养研究生2人，顺利完成了相关的研究任务。