刺参消化道再生过程中microRNA对细胞外基质重建的调控作用

Sea cucumbers possess a surprising regenerative capacity. Extracellular matrix (ECM) remodeling is one of the most important cell behaviors in the process of intestine regeneration of sea cucumbers. Its regulatory mechanism is scarcely reported, therefore the relative research is required. In this project, regenerative intestine of different developmental stages is sampled to launch the researches as follows. The variation characteristics during ECM remodeling is identified by immunochemical technique. The microRNA library and expression profiles of regenerative intestine is constructed by RNA-Seq technique, which then will be verified by microarray technique. Based on the pre-constructed transcriptome and expression profiles of sea cucumbers regeneration, the microRNA and target genes regulating ECM remodeling are screened. The features of mRNA and protein expression of the key target genes are elucidated in ECM remodeling by Real-time PCR and Multiple reaction monitoring protein analysis. The basic regulatory way and mechanism of microRNA will be discussed using correlation analysis in ECM remodeling, providing new insight into the research to regenerative mechanism of sea cucumber regeneration and microRNA regulation of special physiological behavior in Echinodermata.

刺参具有超强的再生能力，细胞外基质重建是刺参消化道再生过程中最重要的细胞活动之一，其调控机制的研究亟待系统开展。本项目以刺参再生过程中的消化道为材料，利用免疫组织化学技术，查明刺参消化道再生过程中细胞外基质重建的变化特征；利用RNA-Seq技术构建刺参消化道再生的microRNA文库及表达谱，利用microarray技术加以验证，以构建的刺参再生转录组和表达谱为基础数据筛选调控细胞外基质重建的microRNA及其靶基因；采用microarray和多反应监测目标蛋白分析技术，查明靶基因在细胞外基质重建中mRNA和蛋白表达的特征，关联分析揭示microRNA对细胞外基质重建的调控作用，为刺参再生机制的研究提供新认知，为棘皮动物特殊生理行为的microRNA调控研究开拓新途径。

刺参具有超强的再生能力，细胞外基质重建是刺参消化道再生过程中最重要的细胞活动之一，其调控机制的研究亟待系统开展。本研究以刺参不同再生阶段的消化道为材料，利用免疫组化技术阐明了刺参消化道再生期间细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)成分变化情况，查明ECM主要成分Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、层黏连蛋白(Laminin)和纤连蛋白(Fibronectin)的降解与重建过程：Ⅰ型胶原蛋白和层黏连蛋白发生明显的降解与重建，而纤连蛋白的含量变化相对较小。构建了刺参再生microRNA文库和表达谱，刺参的肠道中共鉴定出2616 miRNAs；查明了刺参消化道再生过程中microRNA的调控变化特征，并利用Real-time PCR对19个microRNA的表达进行验证；再生中73个microRNA基因发生显著性差异表达(上调：59，下调：14)，其中miR-1715-5p 和 miR-3963在消化道再生第三天表达量上调100倍以上发生了显著上调，且对其调控的靶基因进行研究。查明基质金属蛋白酶基因MMP-2与MMP-16的mRNA与蛋白表达调控特征且发现其与细胞外基质成分的表达呈明显的负相关，表明MMP-2与MMP-16直接调控了细胞外基质成分的降解与重建，揭示了miR-29b 和miR-146b-5p通过调控MMP-2, MMP-16的表达来调控消化道再生过程中细胞外基质的降解和重建，对刺参再生起到重要的调控作用；构建了蛋白表达谱，关联分析查明了靶基因的蛋白表达特征，查明了细胞外基质重建相关蛋白Collagen alpha-1，Fibropellin, Tenascin等的表达变化特征。这些结果为刺参再生机制的研究提供新认知，为棘皮动物特殊生理行为的microRNA调控研究提供了新的思路。