孢子霉素的工程化改造

Because of their defined action mode, structural stability and low toxicity on mammals, along with the effectiveness on some drug-resistant bacteria, fungal defensins are emerging as leads of new-type of antibiotics. Nevertheless, compared with conventional antibiotics they show relatively low activity and the consequent nonspecific cytotoxicity and high cost, hindering their development in clinical application. It is thus imperative to develop new engineering strategies to enhance their bactericidal activity. The applicant identified the first fungal defensin (micasin) from a dermatophytic fungus with therapeutic potential and showed the role of mutations at site 8 in enhancing the activity of the peptide. The activity enhancement is independent on the side-chain characteristics of amino acids introduced and the location of the site is distant from the functional surfaces of this class of defensins, suggesting that allosteric regulation optimizing the conformation of the micasin functional regions could be the molecular basis of the enhancement. This project plans to testify this hypothesis through molecular dynamics simulations and experimental approaches, from which a series of enhanced micasin derived from mutations at this site will be generated. The hypothesis of allosteric regulation in improving the antibacterial activity of micasin is firstly proposed, with theoretical and technical innovations. The strategy developed here will be likely applied to engineering of other antimicrobial peptides.

因为作用机制明确、结构稳定、对哺乳动物低毒且对一些耐药细菌有效，真菌防御素正在成为研发新型抗生素的先导分子。尽管如此，相比于传统抗生素，真菌防御素较低的活性导致用药量增加，随之产生非特异性的细胞毒性和高额的生产成本妨碍其发展为临床抗感染类药物。开发新的蛋白质工程技术提高抗菌活性势在必行。申请人首次从人类皮肤病原真菌中鉴定到具有高度药物开发潜能的孢子霉素，并发现单点突变第8位氨基酸能够显著改进它的抗菌活性。基于此位点突变介导的孢子霉素的活性增强具有侧链性质不依赖性以及非功能区域定位两大特性，申请人提出孢子霉素活性增强的主要分子基础为点突变诱发的变构调节优化了远端抗菌功能区域的构象。该项目利用分子动力学和实验手段证明这一假说，并指导产生一系列基于此位点饱和突变的增效突变体。基于远端变构调节实现对特定抗菌肽的人工改造为国际首创，具有理论和技术上的创新，其研究成果可用于对其它抗微生物肽的分子改造。

防御素类抗微生物肽因其稳定的空间结构和较强的抗微生物活性而正在被人类用于发展为肽类抗生素先导药物之一。该项目以犬小孢子菌来源的防御素-孢子霉素为主要研究对象，通过理论和实验生物学相结合的方法研究了该防御素的工程化改造的分子基础，揭示了孢子霉素活性增强突变的主要结构生物学基础，即特定点突变引发的远端分子动力学行为改变构成了抗菌活性改变的关键因素之一。同时，本项目还发现增效位点突变与其它功能残基之间可能存在的变构通讯能够调节孢子霉素的抗菌活性。基序嫁接和单点突变实验发现孢子霉素的羧基端环区具有低的突变耐受性。利用活性增效位点的残基关联性，我们工程化改进了孢子霉素增效突变体的热稳定性。另外，我们还发现孢子霉素点突变介导的活性增强具有物种选择性，且此类选择性可能与不同菌种间的细胞壁合成前体物的化学结构差异有关。在此基础上，本项目还开展了一系列的比较研究，发现了孢子霉素的同源基因编码产物，包括真菌来源的Py4以及细菌来源的AMSIN的抗菌活性、作用机制以及治疗潜能。针对新冠疫情，我们实时拓展了孢子霉素在抗SARS-CoV-2入侵方面的可能作用，首次发现孢子霉素可以高亲和与SARS-CoV-2的刺突蛋白的受体结合域（RBD）结合，同时利用工程化改造技术改进了孢子霉素与RBD的结合亲和力。该项目的完成为防御素类分子的人工设计和改造提供了理论和实验基础，同时对于拓展此类分子的抗病毒活性提供了线索。进一步深入研究孢子霉素及其同源物的变构通讯信息有助于建立新的分子设计策略改进它们的活性及热稳定性。