基于一种新的蝎毒素支架的抗感染分子设计

Grafting of exogenous bioactive sites or functional motifs onto structurally stable scaffolds to gain new functions represents an important research direction in protein engineering. Some engineered proteins have been developed into therapeutic drugs. MeuNaTxα-3 is a newly characterized scorpion sodium channel toxin-like peptide isolated from the venom of the Chinese scorpion Mesobuthus eupeus, which contains four intramolecular disulfide bridges and two distinct structural domains. Its rigid scaffold region is highly similar to typical scorpion sodium channel toxins, but the J-loop extends eight amino acids. The extended J-loop (named EJL) constitutes a flexible region extruded from the scaffold and could be used as a vector to graft exogenous sequences. Moreover, MeuNaTxα-3 and its derivatives are easily prepared in E. coli and non-toxic to mammals. This project plans to use MeuNaTxα-3 as a scaffold to graft short-chain anti-infective peptides with different structural types (α-helix, β-sheet and random coil) to experimentally verify its scaffold potential and explore new peptide antibiotic drug leads. This is the first attempt to improve in vivo stability and potency of antimicrobial peptides based on a stable structural scaffold.

在稳定的结构支架上嫁接外源生物活性位点或功能基序形成新的功能分子是蛋白质工程研究的一个重要领域。一些工程化蛋白质已被开发成治疗性药物。MeuNaTxα-3是一个来自于条斑钳蝎毒液的钠通道毒素类肽，含有四对分子内二硫键，具有独特的双结构域组织，其刚性结构的分子核心区域与经典的蝎钠通道毒素高度相似，但是该分子的J环区域发生了8个氨基酸的插入。该延长的J环（命名为EJL）构成了支架的柔性区，可用于嫁接外源生物活性位点衍生新功能。而且MeuNaTxα-3及其衍生物易于重组制备且结构稳定和无毒。该项目拟以该肽支架为基础，通过嫁接不同结构类型（α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲）的短链抗感染序列，实验证实其支架潜能并开发出新型的肽类抗生素药物先导。该项目首次运用多肽支架基于的蛋白质工程技术改进抗微生物肽的活体稳定性和抗微生物活性。

在稳定的结构支架上嫁接外源生物活性位点或功能基序形成新的功能分子是蛋白质工程研究的一个重要领域。一些工程化蛋白质已被开发成治疗性药物。该项目以MeuNaTx-3（简称MT-3）为主要研究对象，通过蛋白质工程技术嫁接了三种不同的外源功能基序（即抗细菌的防御素功能区、血凝素结合基序和蛋白酶抑制剂基序），获得了结构稳定的工程化分子。利用包涵体复性技术，我们获得了高纯度的MT-3及其工程化分子并完成了相应的MALDI-TOF质谱检测分子量，表明实验和理论分子量高度一致。圆二色谱用于分析重组分子的结构特征，证实了所有分子形成了稳定的蝎毒素样结构。利用卵母细胞电压钳技术，我们评估了MT-3及其工程化分子对小鼠钠通道亚型的毒性效应，结果表明所有分子对哺乳动物钠通道缺乏毒性。抗菌活性表明，嫁接了防御素C-环（DCL）的工程化的分子获得了更广的抗菌谱，能够有效杀死金黄色葡萄球菌耐药临床分离株（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus P1386）和丝状真菌。同时，抗病毒实验证实了MT-3(G1A-HBP)对流感病毒H1N1株的显著的抑制活性。MeuNaTxα3G1A-TIL的工程化分子获得了对胰蛋白酶的抑制活性，工程化分子在50 μM浓度下，能够导致85.7%的抑制率。在此基础上，我们开发了MeuNaTx-3相关分子的支架潜能，包括动物来源的抗真菌防御素以及蝎毒液来源的钾通道毒素嫁接外源基序列，获得了期望的效果。该项目的完成为蝎毒素在蛋白质工程领域的应用打开了一扇新的大门，有助于推动多肽类药物研发的发展。