雷公藤甲素对睾丸间质细胞和MLTC-1甾体激素合成的调控机制研究

雷公藤甲素产生的抗雄性生殖调控作用已经明确，但是对其作用靶点和调控机制一直不明确。调节睾丸生精内环境已知能够影响雄性生殖细胞发育成熟，此效应已知与睾丸间质细胞雄激素的生物合成关系最大。本课题组前期研究提示雷公藤甲素在抗生殖调控剂量下，可能是通过调节间质细胞甾体激素合成和分泌，引起曲细精管激素内环境变化，使得雄性生殖细胞变态发育受阻，进而使得成熟精子数目锐减，产生可逆性的抗雄性生殖作用。本研究以原代大鼠睾丸间质细胞和MLTC-1细胞为研究对象，系统地考察雷公藤甲素给药，通过直接作用和支持细胞旁分泌作用对间质细胞睾酮合成和分泌的影响，重点对关键酶P450scc，3β-HSD，17β-HSD，关键通路hCG-cAMP-PKA，PKC，ERK1/2，钙离子通道，胆固醇转运体（StAR，PBR）的作用，并对的调控机制进行验证研究。通过阐明雷公藤甲素引起生殖内分泌调节，寻找安全、有效的雄性生殖调控方法

首先，利用小鼠睾丸间质瘤细胞（MLTC-1）来评价雷公藤甲素对孕酮合成的影响。研究发现雷公藤甲素给药24小时候，当以hCG，CT，FSK，db-cAMP作为刺激剂时，随着雷公藤甲素给药浓度的增加，MLTC-1细胞孕酮的生成量逐渐减少。同样条件下，当以hCG，CT作为刺激剂时，随着雷公藤甲素给药浓度的增加，MLTC-1细胞内cAMP的生成量逐渐减少。当雷公藤甲素给药浓度为75nM时候，StAR核酸和蛋白的表达量分别下降50.54%和84.18%。进一步当添加底物22（R）-羟基胆固醇（22R-HC）、孕烯醇酮（PRL）时，随着雷公藤甲素给药浓度的增加，孕酮的生成量没有显著的变化。因此，雷公藤甲素通过抑制MLTC-1细胞LH/hCG-cAMP-PKA通路和StAR表达，抑制孕酮生成的作用。其次，使用原代大鼠睾丸间质细胞（Leydig cell）模型，考察雷公藤甲素对孕酮合成的影响，研究类固醇合成通路在雷公藤甲素作用后产生的变化。研究发现，用hCG，CT，FSK，db-cAMP作为刺激剂时，随着雷公藤甲素给药浓度的增加，Leydig细胞孕酮的生成量逐渐减少；加入关键酶P450scc、3β-HSD生成孕酮的底物22R-HC、PRL，随着雷公藤甲素给药浓度的增加，孕酮的生成量没有变化。随着雷公藤甲素给药浓度的增加，检测到胆固醇转运体StAR核酸和蛋白的表达水平都有所下降。研究结果提示，雷公藤甲素作用能够引起Leydig细胞睾酮分泌剂量依赖性的减少，对类固醇通路产生多靶点的调控作用，具体通过抑制LH/hcG受体激活，减少cAMP生成抑制cAMP-PKA信号传递；同时通过抑制线粒体膜上的胆固醇转运体StAR的表达，减少类固醇通路胆固醇的供给，最终导致孕酮合成减少。 再次，本研究雷公藤甲素对雄性大鼠精子活力，睾酮分泌量的变化，确定雷公藤甲素对雄性大鼠生殖调控作用产生的时间和剂量依赖性关系。睾丸基因差异表达的结果显示，雷公藤甲素很可能是通过对类固醇激素的调控产生作用的。组织睾酮水平检测结果显示，很可能是通过睾丸间质细胞旁分泌睾酮来实现对精子发生和发育的精确调控。最后，建立核受体、激酶等体外新药活性筛选模型，对雷公藤甲素结构类似物进行活性筛选。研究发现，雷公藤甲素及其同系物对于雌激素、雄激素受体没有直接作用，但是能够抑制KDR、Lck、VR1和COX活性。