miRNA-199家族靶向MAPK通路致翼状胬肉EMT发生的作用机制研究

Pterygium is the commonest ocular surface disease with epithelioid tumor biological characteristics, presents epithelial-mesenchymal transition (EMT). Recently, the role of miRNA in pterygium gets more and more attention, but there is few researches on the detail function of certain miRNA in pterygium formation. We adopted miRNA chip to screen the significant high expression of miR-199 family in pterygium, which was verified in part of the clinical samples. Then we identified the target gene DUSP5 of miR-199a/b-3p, which is the key element in p38-MAPK pathway. And the target gene of miR-199a-5p was reported to be MAP4K3, which was expressed in pterygium. MAPK pathway was reported to play an important role in EMT. So we assume that: miR-199a/b -3p and miR-199a-5p were upregulated in pterygium and targeted DUSP5 and MAP4K3 genes to mediate MAPK pathway, eventually leading to EMT. So, we proposed the following experiments: 1. To expand the pterygium and normal conjunctiva contrast samples, further verify the higher expression of miR-199a/b-3p and miR-199a-5p and the lower expression of target genes in big samples; 2. In vitro experiments to confirm the interaction between miRNA and target genes; 3. After the transfection of human conjunctival epithelial cells with miR-199, to detect the DUSP5 and MAP4K3 levels, and p38, MAPK, MAP4K3 phosphorylation protein levels, and to compare the molecules of EMT and epithelial characteristics; 4. To establish the pterygium model in rabbit eyes, and carry on infection experiments of miRNA. Our purpose is to find a new target for pterygium therapy.

翼状胬肉是常见眼表疾病，有上皮细胞间质化（EMT）的特征表现。近来miRNA在其发病中的作用逐渐受到重视，但缺乏对特定miRNA的深入研究。前期我们采用芯片筛选出了显著高表达的miR-199家族，并进行了临床样本的验证，初步确定了miR-199家族的靶基因DUSP5和MAP4K3，均在与EMT密切相关的MAPK通路上。因此设想miR-199家族靶向MAPK通路致翼状胬肉EMT的发生。拟：1.收集翼状胬肉组织和正常对照的结膜大样本，确认miR-199家族在翼状胬肉组织中的作用；2. 体外实验确认miR-199和靶基因的相互作用；3. 将miR-199转染至人结膜上皮细胞中，检测其DUSP5、MAP4K3水平及p38-MAPK通路、MAP4K3蛋白的磷酸化水平，比较EMT和上皮细胞特征分子的表达；4.建立兔眼翼状胬肉模型，进行腺病毒包装的miRNA感染实验。以期为翼状胬肉寻找新的治疗靶点。

背景：miRNA 参与多种生理活动和疾病的调节，在翼状胬肉中的潜在机制尚未完全揭示，需要进一步研究。.方法：使用微阵列分析 miRNA 在翼状胬肉中的差异表达，并通过定量实时聚合酶链反应 (qRT-PCR) 进行验证。培养人结膜上皮细胞 (HCE) 并用转化生长因子 β (TGF-β) 和表皮生长因子 (EGF) 处理，并用 miR-199a-3p/5p 模拟物和抑制剂转染。使用蛋白质印迹和免疫荧光检测 HCE 中上皮间质转化 (EMT) 的标志物。使用划痕实验和transwell测定法确定细胞迁移能力，流式细胞术检测细胞凋亡。miR-199a的靶基因通过双荧光素酶报告基因测定得到证实。原代培养翼状胬肉成纤维细胞(HPF)并用miR-199a-3p/5p 模拟物和抑制剂转染，检测细胞迁移能力和纤维化标志物。.结果：TGF-β 和 EGF 可诱导 HCE 中的 EMT 并增加 miR-199a-3p/5p 但抑制靶基因 DUSP5 和 MAP3K11。随着EMT的发生，细胞迁移能力增强，细胞凋亡受阻。促进 miR-199a-3p/5p 表达可以在没有 TGF-β 和 EGF 的 HCE 中诱导 EMT，而抑制 miR-199a-3p/5p 可以抑制 TGF-β 和 EGF 诱导的 HCE 中的 EMT。同样地，抑制miR-199a-3p/5p可以降低HPFs的迁移能力和EMT。miR-199a-3p/5p 在翼状胬肉中相比对照结膜组织中过表达更多，而 DUSP5/MAP3K11 的表达较低。生物信息学分析表明miR-199a-3p/5p-DUSP5/MAP3K11属于MAPK信号通路。另外，miR-199a-3p/5p通过抑制靶基因DUSP5/MAP3K11促进了HPFs的纤维化，而抑制miR-199a-3p/5p过表达DUSP5/MAP3K11从而抑制纤维化。.结论：miR-199a-3p/5p-DUSP5/MAP3K11轴调节TGF-β 和 EGF诱导的HCEs的EMT，还参与了HPFs的迁移和纤维化，解释了翼状胬肉EMT和纤维化的发病机制，可能为翼状胬肉的防治提供新的靶点。