TERTpre-mRNA选择性剪接调控NF-κB/MMP9通路对VaD神经炎性反应的作用及分子机制

Telomerase reverse transcriptase (TERT) can directly regulate the transcription of NF-κB, thus participates in the inflammatory reaction. However, alternative splicing of TERT pre-mRNA can express various splicing variants and lose the function of TERT protein. In our previous studies, we found that the expression amount of various TERT splicing variants was different in different cells; Brm, a new splicing factor, involved in the generation of TERT splicing variants; Antisense oligonucleotide mediated exon-skipping could effectively change the splicing patterns of TERT pre-mRNA. Based on our previous studies, the present project puts forward the hypothesis of loop regluation mechanism "TERT pre-mRNA alternative splicing regulates neuro-inflammation of vascular dementia via NF-κB/MMP9 signal pathway". By use of splicing reporter minigene, RNA interference, CRISPR/Cas9 and ChIP technology, we will explore the role and mechanism of TERT pre-mRNA alternative splicing in neuro-inflammation, and verify the hypothesis in vitro and in VaD model rats. Our research will illuminate the molecular mechanism of inhibition of VaD neuro-inflammation by regulating TERT pre-mRNA alternative splicing, and provide new clues and new targets for the onset and treatment of VaD.

端粒酶蛋白亚基TERT可直接调控关键炎性因子NF-κB的转录活性，从而参与炎性反应。但是，TERT pre-mRNA存在选择性剪接，可表达多种形式的剪接体而使TERT蛋白失去功能。申请者在上一个国家自然科学基金研究中发现：不同细胞的各种TERT剪接体表达量不同；剪接因子Brm参与了TERT剪接体生成；新型反义寡核苷酸介导的外显子跳跃能有效改变其剪接形式。在此基础上，本项目提出“TERT pre-mRNA选择性剪接通过NF-κB/MMP9信号通路调控VaD神经炎性反应"的环路调控假说。拟采用剪接报告minigene、RNA干扰、CRISPR/Cas9、ChIP等技术，研究小胶质细胞中TERT剪接对神经炎性反应的作用及其信号通路，并在大鼠模型上进一步验证其与认知功能障碍的关系。本项目将对阐明调控TERT剪接抑制VaD神经炎性反应的分子机制具有重要意义，为VaD的治疗提供新的思路和重要的新靶点。

端粒酶蛋白亚基TERT可直接调控关键炎性因子NF-κB的转录活性，从而参与炎性反应。但是，TERT pre-mRNA存在选择性剪接，可表达多种形式的剪接体而使TERT蛋白失去功能。我们在前期研究中发现：不同细胞的各种TERT剪接体表达量不同；剪接因子Brm参与了TERT剪接体生成；新型反义寡核苷酸介导的外显子跳跃能有效改变其剪接形式。在此基础上，我们在本项目中，采用RNA干扰、CRISPR/Cas9、ChIP等技术，研究小胶质细胞中TERT剪接对神经炎性反应的作用及其信号通路，并在大鼠模型上进一步验证其与认知功能障碍的关系。主要研究内容包括：（1）在细胞水平（in vitro）上研究了TERT pre-mRNA选择性剪接对VaD神经炎性反应具有调控作用。缺氧微环境及剪接调控因子可改变TERT pre-mRNA选择性剪接形式。TERT pre-mRNA选择性剪接变化后对神经炎性因子表达有一定的调控作用。（2） 研究了TERT pre-mRNA选择性剪接影响神经炎性反应的分子机制。在小胶质细胞中全长型及各种截短型TERT直接调控NF-κB转录，与NF-κB p65相互作用并激活MMP9和NF-κB下游炎性因子的表达。（3）在VaD大鼠模型上进一步验证，研究全长型及各种截短型TERT mRNA及神经炎性相关因子在VaD大鼠海马组织各区中的表达情况，综合分析了VaD大鼠模型中TERT pre-mRNA选择性剪接形式可调控炎性因子表达及影响认知功能障碍。通过本项目研究，我们提出“TERT pre-mRNA选择性剪接通过NF-κB/MMP9信号通路调控VaD神经炎性反应"的环路调控假说。本项目对阐明调控TERT剪接抑制VaD神经炎性反应的分子机制具有重要意义，为VaD的治疗提供新的思路和重要的新靶点。