NF-κB分子的选择性剪接对栉孔扇贝免疫应答的调控

NF-κB/IκB通路是一条在进化上比较保守的免疫信号传导通路，其在机体免疫应答反应中发挥着重要作用。通过前期研究，课题组从栉孔扇贝中获得了该通路的多个关键基因，并且发现栉孔扇贝NF-κB分子存在选择性剪接现象。本课题拟采用Genome Walking等技术从栉孔扇贝中克隆NF-κB分子全基因序列及不同剪接异构体的cDNA序列，检测不同NF-κB异构体对免疫应答反应的调控作用，探讨影响NF-κB分子选择性剪接的因素；通过EMSA、Pull down、免疫共沉淀、转染试验等，解析NF-κB异构体转录激活功能的差异以及其与IκB1、IκB2抑制活性的对应关系，探究不同NF-κB异构体间的相互协调方式。通过开展上述研究，深入探讨栉孔扇贝免疫防御的分子机制，为其病害防治和健康养殖提供理论依据；同时为探索已存在数十亿年、从低等生物到人类仍然保留的原始固有免疫信号通路的进化提供证据。

在基金项目的资助下，通过RACE技术从栉孔扇贝中获得了NF-κB、IκB等该通路的多个关键基因，发现NF-κB分子cDNA序列存在不同的长度；分析表明，NF-κB-1分子含有完整RHD结构域和转录激活结构域，而NF-κB-2则仅具有部分RHD结构域，缺乏转录激活结构域；在此基础上，通过Genome walking技术克隆得到NF-κB分子的全基因序列，确认了不同长度的NF-κB分子是同一基因选择性剪接的不同产物。采用Western blot技术分析了NF-κB-1蛋白的细胞分布及LPS刺激后核内蛋白含量的变化情况；结果发现，正常生理状态下，NF-κB-1在胞质和核内均有分布，其中核内含量要高于胞质；在LPS刺激3h和12h后，栉孔扇贝血淋巴细胞核内NF-κB-1蛋白含量显著增加，表明NF-κB已移位到细胞核内调控相关基因的转录。采用NF-κB荧光素酶报告基因系统检测了NF-κB的转录活性和IκB的转录抑制活性；结果发现，NF-κB-1具有显著的转录激活活性（122.43%，P<0.05），而共转染IκB则可显著抑制NF-κB-1的转录激活活性（17.61%，P<0.05）。利用荧光定量PCR 分析了栉孔扇贝NF-κB-1基因在脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)刺激后的时序表达情况；结果发现，LPS刺激导致NF-κB基因表达水平变化显著：在6 h表达水平为对照组的25.25倍；随后降至对照组水平，在24 h再次升高并达到最大值(59.66倍)。在PGN刺激组，NF-κB基因的表达量在3 h升高至最大值(2.35倍)，随后恢复至对照组水平。采用半定量RT-PCR方法检测了LPS刺激后NF-κB-2基因的表达情况；结果发现，在正常生理状态下及LPS刺激早期阶段，NF-κB-2转录本表达水平仍处于较低状态；随着LPS刺激时间的延长，NF-κB-2基因表达水平出现上调，表明NF-κB-2分子可能作为NF-κB/IκB信号通路的负调控分子发挥作用。此外，建立了正常血淋巴细胞以及经鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后的血淋巴细胞SAGE文库；分析发现，Toll receptor、TRAF6等NF-κB/IκB信号通路相关分子参与了宿主抵抗鳗弧菌感染的免疫应答。上述结果表明，NF-κB/Iκ通路在栉孔扇贝的免疫应答反应中发挥着重要作用，而NF-κB分子的选择性剪接可能是该信号通路调节方式之一。