家蚕肠道TCTP蛋白的免疫功能研究

Insect gut immunity is the first line of combating orally infected pathogens. Our knowledge about the molecules involved in pathogen recognition, signal transduction, immune regulation or as immune effectors in silkworm intestine is still limited. To explore the molecular mechanism of silkworm intestinal immunity, a T7 phage display cDNA library of the silkworm intestine has been constructed, and by use of different ligands for biopanning, TCTP molecule has been identified to bind these ligands. To further characterize the immunological functions of TCTP in silkworm intestine, we plan to carry out studies to determine TCTP spatio-temporal expression profile, to identify its ability to bind to pathogen-associated molecules and to prime the immune system. Moreover, the signaling pathway which TCTP is initiated will also be evaluated. By detecting the change of TCTP expression in different intestinal components during oral infection, the binding ability to different pathogen or pathogen associated molecules as well as its effect to induce the release of histamine or anti-bacterial peptides, we will identify the roles that TCTP plays in silkworm intestinal immunity. Then by analyzing the various signal transducing molecules, we will elucidate the pathway underlying the immunological functions of TCTP. This study will shed a light upon the molecular mechanism of silkworm gut immunity and provide a reference for its application in designing pathogen-resistance strategies.

昆虫肠道免疫是抵御病原体食下感染的第一道防线。对家蚕肠道免疫中所涉及的病原体识别分子、信号传递分子、效应分子以及免疫调节分子的研究还比较缺乏。为探索家蚕肠道免疫的分子机制，在已构建的家蚕肠道cDNA噬菌体展示文库的基础上，以多个病原体相关的模式分子为配体进行淘洗，筛选获得了TCTP蛋白。为深入研究家蚕肠道TCTP的免疫功能，本项目拟从TCTP的时空表达模式、病原体相关分子的结合能力、TCTP对免疫系统的活化功能以及其所介导的信号通路等几个方面开展研究工作。通过检测食下感染的家蚕肠道各区域TCTP的表达水平变化并鉴定TCTP蛋白作为病原体相关分子的结合能力以及对组胺或抗菌肽的诱导作用来解析TCTP分子在肠道免疫中的具体功能；通过检测多种信号传递分子的变化，来揭示其介导的免疫应答反应的分子机理。本项目的研究工作，将对全面了解家蚕免疫，尤其是肠道免疫提供基础，并为家蚕抗病机制的利用提供参考。

昆虫肠道免疫是抵御病原体食下感染的第一道防线。尽管通过基因组学、蛋白质组学等研究手段鉴定了不少参与昆虫肠道免疫的分子，但对于昆虫肠道免疫应答的机制以及其涉及到的未知免疫相关分子，所知有限。利用已构建的家蚕中肠 cDNA T7噬菌体展示文库，筛选到一个能结合多种病原微生物或病原相关的分子模式的蛋白——受翻译控制的肿瘤蛋白（TCTP）。TCTP 由肠道细胞合成并分泌到肠腔中，但不能穿透围食膜进入肠液。微生物食下感染家蚕后，肠腔中的TCTP含量在感染早期迅速升高，之后缓慢下降。体外结合实验证实了TCTP具有结合多种配体的能力。血细胞吞噬实验表明TCTP能促进血细胞对微生物的吞噬，起着调理素的作用。另外，TCTP 可以诱导家蚕 BmNs 细胞产生抗菌肽，且该免疫诱导功能依赖于ERK，而TCTP的诱导也导致了某细胞膜蛋白的酪氨酸磷酸化。以上试验结果说明TCTP即能通过增强血细胞的吞噬作用参与细胞免疫，又能通过诱导抗菌肽的表达参与体液免疫。为进一步在个体水平上研究TCTP对肠道免疫的作用，通过向家蚕蚕卵显微注射piggyBac载体，构建了肠道特异的TCTP RNAi转基因家蚕品系。对转基因家蚕添食致病微生物后发现，转基因家蚕肠道抗菌肽不能被诱导上调表达，且家蚕存活率降低。并且，转基因家蚕肠道中的ERK磷酸化水平比较低，且变化异常。这些结果说明转基因家蚕因RNAi导致TCTP的表达水平降低，从而扰乱了ERK的动态磷酸化，因此肠道免疫受到了抑制。