PPE68抗原修饰的ΔRpfB卡介苗预防结核分枝杆菌感染的实验研究

RpfB是Mtb（结核分枝杆菌）分泌的五个复活促进因子之一，它具有抑制固有免疫系统抗菌活性的作用，与Mtb逃脱免疫防御而引起的慢性感染和潜伏感染有关。卡介苗由于也拥有RpfB基因而削弱了其激活机体产生抗Mtb固有免疫应答的能力。PPE68是BCG缺失的Mtb保护性抗原成分。本课题拟用新型分枝杆菌不相容的质粒基因敲除系统构建RpfB基因敲除的重组BCG，同时构建PPE68的真核表达质粒pPE2； 将pPE2克隆扩增并转化到RpfB基因敲除的重组BCG 中，得到新型重组BCG (ΔRpfB/ PPE68 BCG)活疫苗，并从细胞水平和活体水平研究其在小鼠结核病模型中的免疫保护作用及其相关机制；与BCG比较该新型重组BCG具有使宿主对Mtb的抗性增强,毒力减弱，疫苗的免疫原性增强等优点，为寻求一种比BCG更有效的抗结核疫苗奠定基础。

结核病是位居单一病原引起病人死亡的严重传染病之首，卡介苗（BCG）用于预防结核病已有80多年的历史，但其免疫效果为0-80%不等。RpfB是结核分枝杆菌（Mtb）分泌的五个复活促进因子之一，它具有抑制固有免疫系统抗菌活性的作用，与Mtb逃脱免疫防御而引起的慢性感染和潜伏感染有关。PPE68是BCG缺失的Mtb保护性抗原成分。本课题着眼于改造BCG：得到新型重组BCG (ΔRpfB/ PPE68 BCG)活疫苗，并从体内实验研究其免疫原性和抗Mtb免疫应答的特征。本课题构建了重组BCG所需的质粒及鉴定：包括了PPE68抗原原核表达质粒、PPE68抗原真核表达质粒、IPR1真核表达质粒、PPE68/IPR1共表达真核质粒、RpfB基因敲除质粒；完成重组BCG构建：包括了PPE68/OriM重组BCG、IPR1/OriM重组BCG、PPE68/IPR1/OriM重组BCG、ΔRpfB /OriM重组BCG;将构建好的DNA疫苗和重组BCG免疫BALB／c 小鼠，并探讨重组疫苗的毒性、免疫原性和免疫保护作用及其相应机制。同时，对PPE68的功能进行深入的研究，首次在真核细胞系中表达该原核蛋白，原核表达的PPE68蛋白纯化后免疫动物获得特异性抗体；分别使用PPE68蛋白和抗PPE68蛋白抗体作为诊断试剂去检测结核病患者血清中相应的抗体或抗原。结果：DNA疫苗中pBPO(pBud+PPE68+OriM)组和pBIPO(pBud+Ipr1+PPE68+OriM)组小鼠血清中IgG2α、IFN- γ水平明显高于其他组；且pBIPO(pBud+Ipr1+PPE68+OriM)组IL-12水平也高于其他组；重组BCG中，PPE68/OriM重组BCG组小鼠血清的IgG2α水平提高，CD4+ ／CD8+Th比值下降，提示产生有效地Th1型细胞免疫应答；但是PPE68/OriM重组BCG组和OriM重组BCG组IFN-γ和IL-12水平含量虽然明显高于生理盐水组，但低于BCG组(P<0．05) 。重组的PPE68蛋白在肺外病患者的血清学检查中，敏感性为98.2%，特异性为79.7%，准确度为88.1%，该方法快速有效，有望成为肺外结核病诊断的辅助诊断。