DNA光修复酶和隐色素作用机理异同的分子水平研究

DNA光修复酶(DNA photolyase)可利用300-500nm波长的光能修复紫外线造成的DNA损伤。目前普遍认为DNA光修复酶通过光诱发的电子传递反应进行修复。但其反应的有些细节如底物的电子回传路径尚未确切阐明。隐色素(Cryptochrome)是较近发现的一类蛋白，在动植物（包括人类）及一些微生物中均有发现，其序列和结构与DNA光修复酶高度同源，但不具有或只具有很低的修复功能。研究表明隐色素是一种重要的光受体，在调整生物节律中起作用。隐色素在植物中参与控制光形态建成以及开花时间；在动物体内其不仅被认为与生物节律有关，最近还推测其可能是鸟类和昆虫的磁场感受器，起生物罗盘作用。但隐色素的具体作用机理目前并不十分清楚。本项目拟通过对这两类蛋白的序列分析，寻找与它们作用机理相关的保守以及相异的残基，以DNA光修复酶为基础，通过构建突变克隆并表达重组蛋白，在分子水平研究两者作用机理的异同。

DNA 光修复酶可利用光能修复紫外线造成的DNA 损伤。隐色素是光修复酶的同源蛋白，但不具有修复活性，目前认为隐色素是一类生物钟蛋白，在调控生物节律方面起作用。本项目以大肠杆菌光修复酶为基础，利用生物信息学方法比对分析与其同源蛋白隐色素的序列，寻找与他们作用机理相关的保守或不同的残基，通过分子生物学方法构建突变克隆并表达重组突变蛋白，以在分子水平研究两者作用机理的异同。自项目开展以来，工作主要从两方面开展。其一是继续研究大肠杆菌光修复酶在细胞内外的性质，为进一步寻找和隐色素作用机制异同点打下基础。其二是根据现有文献以及我们的实验结果和预测，选择了若干位点进行突变研究，尝试表达突变蛋白并分析其性质。在第一个方面，我们经过研究发现，大肠杆菌光修复酶基因的mRNA表达水平和培养温度等外界因素影响不大，但光修复酶蛋白及其活性随培养温度上升而显著下降，这种下降可能和光修复酶的热稳定性较差有关。在第二个方面，我们通过四引物法成功构建了光修复酶基因Met345位，Ala377位和Asn378位的15个点突变，并对突变蛋白的表达纯化条件作了探索，得到了一套高效的表达、纯化突变蛋白的方法。通过对突变蛋白的性质进行分析，我们发现根据Ala377位隐色素同源序列设计的大部分的突变蛋白仍然具有和野生型类似的活性；突变蛋白均具有MTHF辅酶；突变蛋白的FAD辅酶氧化还原性质和野生型类似，纯化后也均存在自由基状态，但Ala377Ser突变在空气中氧化速度变慢，而Ala377Cys, Ala377Val, Ala377Ile突变氧化速度则略有加快。在强蓝色光光照条件下，我们发现Ala377Cys, Ala377Val, Ala377Ile突变蛋白存在FAD辅酶脱落的现象，有可能是光照导致蛋白构象发生改变；而野生型和Ala377Ser突变在强蓝色光光照下稳定，无辅酶脱落现象。这可能与拟南芥隐色素Cry1和Cry2的不同特性有关：Cry1在强光下发挥作用，而Cry2在弱光下发挥作用，并且在强光下迅速降解；而拟南芥Cry1和Cry2的在Ala377同源位点恰好分别是Ser和Cys。我们推测FAD辅酶脱落可能是Cry2强光下降解的起始步骤之一。这个发现可能对深入认识隐色素的进化过程以及其在不同条件调控生物钟的作用机理有所帮助。