锌介导Nrf2信号通路保护热应激公猪生精细胞氧化损伤的作用机理

It is a severe problem on boar's production interrupted by heat stress in summer. A remarkable symptom of heat stress in boars is a reduction of semen quality. It may be due to oxidative stress induced by heat stress. However, the mechanism of heat stress induced poor semen quality remains unclear. Zinc is an essential micronutrient, which exerts an antioxidant activity. Keap1-Nrf2-ARE signaling plays a significant role in protecting cells from endogenous and exogenous stresses. Zinc ion binds to Keap 1 protein in Nrf2 signal pathway, in turn, activates Nrf2 transcription factors and their downstream antioxidant system to protect cells from oxidative damage. However, the mechanism of the protective effects of zinc through the Nrf2 signaling pathways on heat stress-induced oxidative damage in boar sperm cells has not been explored. In this study, we will employ a stressed boar model and use immunohistochemistry, flow cytometry, real-time RT-PCR, western blot, and RNA interference analyses, to clarify the mechanism of heat stress-induced oxidative damage in spermatogenic cells, and demonstrate the critical role of Nrf2 signal pathway activated by the zinc. Our study will provide the reliable scientific evidences for ameliorating the reduction of semen quality, improving the reproductive performance in boar, and increasing the economic benefit in animal husbandry.

热应激一直是困扰公猪生产的难题。有研究显示，热应激可以引起雄性动物生精细胞的氧化损伤，导致动物精液品质下降，但其作用机制尚不清楚。Keap1/Nrf2/ARE信号通路是近年发现的动物体内抵抗环境应激的重要信号通路。另外，锌是动物体所必需的微量元素，可以与Nrf2信号通路上的Keap1位点结合，激活Nrf2转录因子，启动下游抗氧化体系，保护细胞免受损伤。但是，目前有关锌调节Nrf2信号通路缓解动物生精细胞氧化损伤作用的研究尚未见报道。因此，本项目以热应激公猪为实验动物，利用免疫组织化学、流式细胞术、荧光定量PCR、Western blot以及RNA干扰等方法研究锌调控Nrf2信号通路保护热应激公猪生精细胞损伤的作用及机理，阐明热应激对公猪生精细胞的氧化损伤作用机制，为预防和缓解高温对公猪精液品质的影响，提高公猪繁殖性能提供科学依据，为增加畜牧业经济效益具有一定指导意义。

热应激引起公猪睾丸机能减退，精液品质下降，严重影响公猪的生产性能。锌是动物体所必需的微量元素，可以与Nrf2 信号通路上的Keap1 位点结合，激活Nrf2 转录因子，启动下游抗氧化体系，保护细胞免受损伤。本项目，我们首先研究了夏季高温对公猪精子生成的影响，明确了高温可导致公猪精液品质下降，并且发现公猪精母细胞和精子细胞对环境高温较为敏感，易受到损伤。其次，在人工气候室建立了巴马香猪公猪热应激模型，利用这一模型，进一步明确了热应激可引起睾丸组织发生氧化损伤，睾丸生精细胞胞核中Nrf2蛋白强烈表达以及Nrf2下游抗氧化基因表达增加，这说明Keap1-Nrf2-ARE信号通路可作为保护睾丸生殖细胞免受氧化应激的一个新靶点。通过进一步研究发现，预饲1500mg/kg锌日粮可以提高巴马香猪的生产性能，维持热应激过程中血清锌的浓度，增加睾丸组织Nrf2蛋白及下游靶基因NQO1和GCLC mRNA表达水平，明确了日粮锌是通过激活睾丸组织Nrf2-Keap1/ARE通路来缓解热应激引起的睾丸生殖细胞的氧化损伤。在热应激巴马香猪附睾组织分析发现日粮锌改善了热应激公猪附睾组织形态和抗氧化功能。利用小鼠睾丸间质细胞系MLTC-1研究发现锌可以有效缓解热应激引起的细胞凋亡，并且发现细胞自噬参与了这一过程。另外，项目还利用热应激小鼠模型进一步研究了锌的缓解保护作用，发现锌可通过上调Cu-Zn SOD蛋白表达，缓解热应激诱导的小鼠睾丸生殖细胞的氧化损伤；对肝脏功能分析发现锌可激活p62-Nrf2-ARE信号通路，参与缓解热应激损伤肝脏的相关分子机制。本项目研究结果为预防和缓解夏季高温对公猪精液品质的影响以及提高公猪繁殖性能方面提供科学依据，并为提升种公猪生产效益提供新的解决方法。