雨生红球藻中虾青素靶向S6K1抑制甲状腺肿瘤干细胞的分子机制研究

Astaxanthin extracted from Haematococcus pluvialis is the best nature antioxidant available until now. Our previous work found it with significant effect on inhibiting thyroid Cancer Stem Cells (CSCs), and can stimulate relate proteins by S6K1. The thyroid CSCs has been confirmed responsible to the failure treatment and recurrence of thyroid cancer. Hitherto, there is no report on the inhibition of astaxanthin on CSCs. This project will establish in vitro cell model and in vivo mouse model for tumor experiments, aiming to explore the target sites and molecular mechanism of astaxanthin on CSCs. To determine the S6K1 as the potential target, western blot, chemiluminesence, and cell viability assay will be applied. The role of S6K1 kinase in tumor inhibition will be confirmed using gene silencing, immunofluorescence, and flow cytometers. By tumor size measurement, immunohistochemical analysis on scattering and expression of marker proteins in a subcutaneous tumor model of mouse, the mechanism of astaxanthin interfering tumorigenicity by targeting S6K1 will be identified. This study will provide fundamental knowledge in the development and application of H. pluvialis and astaxanthin extracts in controlling thyroid cancer, and enhancing nutritional and health.

雨生红球藻中提取的雨生虾青素是目前发现的最强天然抗氧化剂。我们的前期工作首次发现其在抑制甲状腺肿瘤干细胞方面也有效果，能通过S6K1对相关蛋白的表达产生影响。甲状腺肿瘤干细胞是与甲状腺肿瘤治疗失败和复发密切相关的特异性肿瘤细胞。目前关于雨生虾青素作用于肿瘤干细胞的研究还是空白。因此，本项目拟建立体外细胞和体内小鼠肿瘤模型，旨在探索雨生虾青素对甲状腺肿瘤干细胞作用的靶点及分子机制。通过Western blot、化学发光法和活细胞检测系统等方法确定S6K1为作用靶点；运用基因沉默技术结合免疫荧光和细胞流式等手段探究雨生虾青素通过靶向S6K1对细胞增殖的影响；建立小鼠皮下肿瘤模型，通过肿瘤监测、免疫组化分析等手段检测标志性蛋白的分布和表达，探究雨生虾青素靶向S6K1干预甲状腺肿瘤干细胞诱导成瘤的机制。本研究为雨生红球藻及其提取物虾青素在控制甲状腺肿瘤以及在营养健康方面的开发应用提供理论依据。

雨生红球藻中提取的雨生虾青素是最强天然抗氧化剂，可以通过多种生物应用手段控制包括肿瘤、糖尿病在内的多种疾病。甲状腺肿瘤是一种内分泌恶性疾病，也是最常见的致死内分泌肿。我们的前期实验发现雨生虾青素对甲状腺肿瘤干细胞具有显著的抑制作用，但作用机制不明确。本项目通过研究发现雨生虾青素抑制甲状腺肿瘤干细胞株并对 PI3K 和 MAPK 信号通路产生影响，尤其是上调了 PI3K 信号通路上 pS6K1 的表达，但是抑制了其底物 S6 的磷酸化。这一特殊情况与 S6K1 的作用密切相关，暗示了 S6K1 是作用靶点；酶活性实验显示雨生虾青素可以直接显著的抑制 S6K1 激酶的活性；通过软件对虾青素靶向 S6K1 进行结构预测和模型验证，实验证明雨生虾青素在 ATP 结合位点通过与氨基酸 Glu173 和 精氨酸 298 与 S6K1 之间形成氢键完成分子对接；通过 sphere formation 方法直接观察到雨生虾青素 48 h 处理的干细胞在培养 7 d 后，其成球较小，成球率下降，直观数据表明雨生虾青素对甲状腺肿瘤干细胞的诱导和分化具有抑制作用；Gli、BMI1、SOX2 三个与干细胞诱导更新相关的蛋白在甲状腺癌细胞 KAT-18 中的表达呈雨生虾青素计量依赖型下降；雨生虾青素阻滞甲状腺肿瘤干细胞的细胞周期于 G2/M 期，这一结果表明雨生虾青素极有可能是通过靶向 S6K1 后介导肿瘤干细胞 G2 期周期阻滞，从而抑制甲状腺肿瘤干细胞的增殖；进一步的小鼠异种移植肿瘤实验也显示，雨生虾青素灌胃组的成瘤低于模型组。本研究证明雨生虾青素是通过靶向 S6K1 抑制甲状腺肿瘤干细胞诱导成瘤的。研究结果对雨生虾青素在控制甲状腺肿瘤等方面的合理利用提供理论参考。