神经细胞粘附分子介导猪血凝性脑脊髓炎病毒侵入神经细胞的作用机制研究

Hemagglutinating encephalomyelitis virus (HEV) causes porcine hemagglutinating encephalomyelitis. HEV has a strong tropism for the nervous system. We discovered that the neural cell adhesion molecule (NCAM) that interacts with the HEV spike protein and the anti-NCAM antibody inhibit binding of HEV to nerve cells. Therefore, we speculate that the NCAM might be the receptor of HEV which is on the surface of the nerve cells. In order to reveal the mechanism of HEV by the NCAM-mediated invasion of nerve cells, we use the experimental infection and syncytium formation assay to investigate the dynamic NCAM-mediated HEV entry process. We use bioinformatics methods to figure out the binding targets of HEV and NCAM. The prospective results is essential for understanding the pathogenesis of HEV and the pathogenesis of chronic neurological diseases caused by viral infection.

血凝性脑脊髓炎病毒（HEV）引发仔猪血凝性脑脊髓炎，具有典型的嗜神经性。前期研究发现,神经细胞粘附因子（NCAM）能够与HEV 纤突蛋白（S蛋白）结合，且针对NCAM的抗体能阻断其与神经细胞的结合，因此我们推测NCAM可能是HEV在神经细胞膜表面的受体。为了揭示由NCAM介导HEV入侵神经细胞的作用机制，本项目拟利用感染试验与合胞体形成试验，对HEV入胞的动态过程进行研究；结合生物信息学方法，鉴定出HEV与NCAM的结合靶位；通过间接免疫荧光等方法对HEV血凝素-酯酶（HE蛋白）与NCAM多聚唾液酸（PSA）间的互作进行检测；进一步明确NCAM在介导HEV感染神经细胞过程中的作用，深入解析由NCAM介导的病毒-细胞膜的融合机制及病毒粘附机制。本研究不仅有利于阐明HEV致病的分子机制，而且为一些由病毒感染所引起的神经系统疾病发病机制的研究提供了重要的理论依据。

本研究主要探究猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）经神经细胞黏附因子（NCAM）致神经损伤的机制。利用荧光定量PCR技术，Western blot方法以及间接免疫荧光实验，对感染PHEV的小鼠神经母细胞瘤细胞系（N2a）中的NCAM进行检测，发现在PHEV感染N2a细胞的过程中，NCAM mRNA相对表达量逐渐升高；蛋白水平上，随着PHEV的感染时间的延长，NCAM的表达量出现明显的升高趋势，同时间接免疫荧光试验也验证了这一现象。利用NCAM的siRNA转染N2a细胞后，感染PHEV，发现病毒的滴度被明显抑制。间接免疫荧光也证明，在干扰了NCAM的N2a细胞中感染PHEV，病毒的表达量明显降低。为了进一步验证二者的相互作用，体外构建了pCMV-HA-PHEV-S1，pCMV-Flag-NCAM真核表达载体，利用免疫共沉淀实验证明了二者的相互作用；同时构建pGBKT7-BD-PHEV-S1，pGADT7-AD-NCAM重组质粒，利用酵母双杂交实验，发现共转化酵母菌的四缺培养基中出现蓝色菌斑，证明了二者能够相互作用。然而，在病毒入侵机体及细胞的过程中，会有不止一种蛋白或者糖类参与这个过程，所以我们利用酵母双杂交的实验筛选与PHEV-S1蛋白相互作用的蛋白，发现Snapin蛋白在酵母回转实验中表现出较高的活性，所以我们针对该基因在病毒的感染过程中的变化做了检测，发现在PHEV感染神经细胞的过程中，该基因的表达呈现上升趋势，同时，干扰掉该基因后，病毒的复制也受到了影响。这为我们深入研究PHEV致神经损伤的机制研究提供了很好的基础。也提示在PHEV入侵神经细胞的过程中，很可能是诱导了几种蛋白相互融合形成复合物的形式进入细胞内部，完成自我装配，增殖并致细胞损伤，发挥致病作用。这些研究成果为下一步深入开展PHEV致神经损伤的机制研究奠定了基础。